30초 요약: 이 글의 요점
- ‘수’는 측정법에 따라 100만 배까지 달라집니다. 측정 장비가 다른 제품끼리 ‘수’를 비교해도 의미가 없습니다.
- 혼입물도 함께 계수되고 있습니다. ‘엑소좀 ○개’라고 적혀 있어도, 실제로는 단백질 덩어리를 세고 있을 수 있습니다.
- 수가 많다고 효과가 큰 것은 아닙니다. 지금의 과학에는 수의 많고 적음과 작용의 크기가 비례한다는 근거가 없습니다.
아래에서 이 세 가지를 ‘세 가지 함정’으로 차례로 살펴봅니다. 모두 국제 지침의 원문에서 직접 확인할 수 있는 내용입니다.
‘엑소좀의 수’를 정확히 셀 수 있는 장치는 아직 없다
왜 ‘○조 개’를 신뢰할 수 없는가
세포외소포(세포가 내보내는, 막에 싸인 미세한 주머니. 엑소좀은 그 한 종류) 연구에는 국제세포외소포학회(ISEV)가 정한 보고 지침이 있습니다. 최신판은 MISEV2023입니다[1].
이 지침은 입자수 측정에 한계가 있다는 점을 명기하고 있습니다. 이유는 단순합니다. 지금의 장치로는 엑소좀만 골라내어 빠짐없이 셀 수 없기 때문입니다.
“…the number concentration (in particles/mL), a metric that is widely reported and used for … in vivo dosing. However, it is often unreliable, since many techniques lack specificity for EVs and sensitivity for all EVs.”
세포외소포의 수는 부피 측정과 합쳐 수 농도(개/mL)를 정하는 데 쓸 수 있으며, 이 지표는 널리 보고되고 시험 투입량의 표준화·결과의 표기·생체 내 투여량 설정에 사용된다. 그러나 이것은 종종 신뢰할 수 없다. 많은 기법이 세포외소포에 대한 특이성과, 모든 소포를 포착하는 감도를 결여하고 있기 때문이다.
MISEV2023 제5.1절 ‘입자수 농도의 정량’에서그래서 지침은 ‘엑소좀 농도’라고 쓰지 말라고 한다
MISEV2023은 여기서 한 걸음 더 나아가 이렇게 권고합니다.
“Unless methods are highly specific for EVs, the output of these measures should be described as pertaining to ‘particles’ or ‘EPs’.”
기법이 세포외소포에 대해 높은 특이성을 가지지 않는 한, 이러한 측정의 출력은 ‘입자(particle)’ 또는 ‘세포외입자(EP)’에 관한 것으로 기술되어야 한다.
MISEV2023 제5.1절 권고 사항에서즉, 정체를 알 수 없는 혼입물까지 포함한 ‘입자 농도’라고 불러야 한다는 뜻입니다. 크기도 마찬가지여서, ‘소포의 직경’이 아니라 ‘입자 직경’이라고 쓰도록 요구하고 있습니다.
뒤집어 말하면, ‘엑소좀 ○개’라고 단언되어 있는 시점에서 그 수치가 무엇을 어떻게 센 것인지 확인할 필요가 있다는 뜻이 됩니다.
측정법이 다르면 같은 검체라도 수가 최대 100만 배 벌어진다
‘A사는 100억 개, B사는 10조 개. 그러니 B사가 낫다’는 성립하지 않는다
흔한 오해입니다. 완전히 같은 검체라도 측정하는 장치(기법)가 다르다는 이유만으로 결과가 최대 6자릿수, 약 100만 배까지 달라진다고 보고되어 있습니다.
“Note that reported EV concentration in blood plasma spans six orders of magnitude depending on the measurement method.”
혈장 중 세포외소포 농도의 보고값은 측정법에 따라 6자릿수(약 100만 배)의 폭을 가진다는 점에 유의하기 바란다.
MISEV2023 제5.1절에서(원전: Johnsen et al., 2019)이것은 오차가 아닙니다. 기법마다 ‘보이는 것’ 자체가 다르기 때문에 생기는 차이입니다. 따라서 측정법이 다른 수치끼리 나란히 놓고 비교해도 의미를 갖지 않습니다.
측정법마다 놓치는 것과, 지나치게 세는 것
NTA(나노입자추적분석)
가장 널리 쓰이는 방법입니다. 빛을 비춰 입자의 움직임을 추적하는데, 이 방식으로는 엑소좀과 ‘단순한 단백질 덩어리(응집체)’를 구별할 수 없습니다. 혈청 유래의 지단백 입자도 마찬가지입니다. 섞여 있으면 그만큼 수가 늘어납니다(과대계수). 반대로 실효 검출 하한은 약 50〜70nm, 소포에서는 약 70〜90nm라는 보고가 있어 그보다 작은 소포는 거기에 있어도 수에 나타나지 않습니다(과소계수).
TRPS(저항 펄스 측정법)
미세한 구멍을 입자가 통과할 때의 전기저항 변화로 측정합니다. 하한은 장치의 감도, 상한은 구멍의 직경으로 정해집니다. 크기 편차가 큰 검체에서의 분해능에 강점이 있다고 여겨지는 한편, 150nm 미만에서는 NTA가 더 많이 검출했다는 보고도 있습니다.
ELISA(CD9 · CD63 · CD81)
소포 표면에 있는 표지 단백질의 양을 재는 방법입니다. 다만 모든 소포가 이 표지를 가지고 있는 것은 아닙니다. MISEV2023은 이 세 가지를 사용하는 방법이 ‘엑소좀이라는 하위 유형에 특이적이지 않다’고 명기하고 있습니다.
총단백질량
검체에 포함된 단백질의 총량입니다. 배지에서 유래한 성분 등도 포함하기 때문에 소포 그 자체의 양을 나타내지는 않습니다.
이것을 한 장의 그림으로 정리하면 다음과 같습니다.
MISEV2023은 NTA가 굴절률이 낮은 입자에 대해 산출하는 최빈 직경에 대해 ‘소포 집단의 참된 최빈 직경이라기보다 장치의 검출 한계를 반영하고 있을 가능성이 있다’며 주의를 환기하고, 평균값뿐 아니라 입자 크기 분포 자체를 제시하도록 요구하고 있습니다. ‘평균 ○nm’라는 수치 하나만 적힌 자료는 이 점에서 정보가 부족합니다.
그리고 지침은 단일한 기법으로 충분하다고 보지 않습니다.
“As a result, no single measurement or method is able to satisfy all EV characterization requirements, and use of orthogonal methods (those that do not have the same measurement limitations) is recommended.”
그 결과, 단일한 측정이나 기법으로 세포외소포 특성 평가의 요건을 모두 충족할 수 있는 것은 없으며, 직교하는 기법(같은 측정상의 한계를 가지지 않는 기법)을 함께 사용하는 것이 권장된다.
MISEV2023 제5장 ‘세포외소포의 특성 평가’ 서두에서‘수가 많으면 효과가 크다’는 과학적 근거는 아직 없다
여기가 가장 중요한 지점입니다
현시점에서 입자수가 많을수록 생물학적 작용이 크다는 근거는 없습니다.
오히려 입자수·입자 크기·대표적인 마커 양이 동등해도 실제 생물학적 활성은 전혀 달랐다는 보고가 있습니다. 표준화된 역가 시험(효력을 재는 시험)이 확립되어 있지 않은 현재, ‘이 정도 수가 들어 있으면 유효하다’와 같은 기준, 즉 최적 입자수라는 수치 자체가 존재하지 않습니다.
임상 연구에서 사용된 양도 제법마다 제각각이어서, 횡단적으로 비교할 수 있는 형태가 아닙니다.
팸플릿의 ‘수’가 크고 작음만으로 제품을 비교하는 읽기 방식은, 현재로서는 근거를 갖지 못한다는 뜻입니다.
오해가 없도록 덧붙입니다. 입자수를 측정하는 일 자체가 무의미한 것은 아닙니다. 같은 측정법으로 꾸준히 측정하면 로트 간 편차를 보는 지표로 기능합니다. 문제는 측정법이 다른 수치를 나란히 놓고 우열을 가리는 것과 수의 많음을 작용의 크기로 바꿔 읽는 것, 이 두 가지입니다.
팸플릿을 읽을 때 확인할 네 가지
그렇다면 여러 제조사의 자료를 받았을 때, 어디를 보아야 본질적인 품질에 가까워질 수 있을까요. 다음 네 가지입니다.
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어떤 장치(측정법)로 측정했는지 명기되어 있는가
측정법이 적혀 있지 않은 수치는 타사와 비교할 의미를 갖지 않습니다. 앞서 본 것처럼 장비의 차이만으로 최대 100만 배의 차이가 생깁니다.
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‘입자수’뿐 아니라 ‘단백질량’도 함께 적혀 있는가
일본재생의료학회의 가이던스[2]는 입자수와 단백질량 양쪽에 상관이 있는 것이 바람직하다고 하고 있습니다. 한쪽만으로는 입자의 내용물이 묽은지 진한지 알 수 없습니다.
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표면 마커는 몇 종류를, 어떻게 조사했는가
국제적인 포지션 페이퍼는 최소 3종류의 반정량적 분석을 요구하고 있습니다. 한 종류만 기재되어 있다면 근거로는 약합니다.
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소포 이외의 혼입물을 어떻게 평가하고 제거하고 있는가
수가 많아도 불필요한 단백질 덩어리뿐이라면 의미가 없습니다. MISEV2023은 비소포 성분이 어느 정도 포함되어 있는지 확인하는 것을 보고 항목으로 들고 있습니다.
이 네 가지가 적혀 있는 자료는 적어도 측정의 한계를 이해한 위에서 수치를 내놓고 있다고 읽을 수 있습니다. 반대로 ‘○조 개’만 크게 적혀 있는 자료는 그 이상의 정보를 가지고 있지 않습니다.
용어에 대한 보충 — ‘엑소좀’과 ‘세포외소포(EV)’
MISEV는 생성 경로를 엄밀히 증명할 수 없는 한, 총칭으로 ‘세포외소포(EV)’라는 말을 사용하도록 요구하고 있습니다. ‘엑소좀’은 다포체라는 세포 내 구조에서 유래한다는 것을 함의하는 말이기 때문입니다.
시판 제품의 상당수는 ‘엑소좀’이라고 표시하고 있지만, 실제로는 유래를 특정하지 않은 소포의 혼합물인 경우가 대부분입니다.
굳이 ‘세포외소포(EV)’나 ‘분비단백체(secretome)’와 같은 정확한 용어를 구분해 쓰는 자료는, 학술적 배경을 이해하고 있는 제조사임을 알려주는 하나의 기준이 됩니다.
엑소좀 자체의 정의·생성 경로·구조는 엑소좀이란에, 막으로 된 주머니만 꺼내면 무엇을 잃는지는 엑소좀만 꺼내면 무엇을 잃는가에, 일본 국내 가이던스가 요구하는 규격 항목은 줄기세포 배양상청액이란에 정리했습니다.
자주 묻는 질문
결국 입자수가 많은 제품을 고르면 되는 것입니까.
그렇게 판단할 수 있는 근거는 현시점에 없습니다. 입자수·입자 크기·대표적인 마커 양이 동등해도 생물학적 활성이 크게 달랐던 예가 보고되어 있습니다. 또한 표준화된 역가 시험이 확립되어 있지 않기 때문에, 최적 입자수라는 수치 자체가 존재하지 않습니다. 수의 많고 적음이 아니라, 어떤 방법으로 측정했는지, 입자 이외의 혼입물을 어떻게 평가했는지를 확인해 주십시오.
타사의 입자수와 당사의 수치를 비교할 수 있습니까.
측정법이 같지 않으면 비교가 되지 않습니다. MISEV2023은 혈장 중 세포외소포 농도의 보고값이 측정법에 따라 6자릿수(약 100만 배)의 폭을 가진다고 기술하고 있습니다. 이는 오차가 아니라, 기법마다 ‘보고 있는 대상’이 다르기 때문에 생기는 차이입니다.
CD9 등의 마커가 검출되면 고품질의 증명이 됩니까.
마커는 어디까지나 ‘소포가 존재한다는 것’의 뒷받침이지 품질의 지표는 아닙니다. 모든 소포가 같은 마커를 가지는 것은 아니며, MISEV2023은 CD9 · CD63 · CD81을 사용하는 방법이 엑소좀이라는 하위 유형에 특이적이지 않다고 명기하고 있습니다. 나아가 같은 지침은 유래를 불문하고 모든 세포외소포를 동정할 수 있는 범용 마커는 현재 알려져 있지 않다고도 기술하고 있습니다.
참고문헌
- [1] Welsh JA, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2):e12404.(국제세포외소포학회 ISEV)
- [2] 일본재생의료학회(협력: 일본세포외소포학회) 「세포외소포 등의 임상 응용에 관한 가이던스(제1판)」 2024년 4월 30일
영문 인용은 MISEV2023 원문에서 발췌한 것이며, 우리말 번역은 당사가 한 것입니다.
본 글은 측정법과 그 한계에 대해 설명한 것입니다. 당사의 줄기세포 분비단백체(세포가 배양 중에 분비한 성분의 총체)는 연구용 시약으로 공급하고 있으며, 특정 질환에 대한 효과를 나타내는 것이 아닙니다.