Суть статьи за 30 секунд
- Увеличение размера клеток — признак старения. Уплощение и рост клеток, прошедших многократные деления, описаны как характеристика клеточного старения, поэтому размер клеток служит рабочим ориентиром для оценки состояния исходных клеток.
- Измеренная разница — в 1.5 раза по диаметру и примерно в 3.4 раза по объёму. Стандартная среда дала диаметр 22.3 μm за 30 дней культивирования, собственная среда — 14.9 μm за 20 дней.
- Цель — управление качеством производства, а не утверждение о лечебном эффекте. Эти записи нужны для того, чтобы состояние клеток на момент сбора оставалось одинаковым от партии (единицы продукции, изготовленной за один раз в одинаковых условиях) к партии.
1. Что показывает увеличение размера — «абонемент» на деления
Сразу к сути: увеличение размера описано как признак старения, который проявляется у клеток после многократных делений. Это не только внешнее изменение — это показатель состояния клеток.
Известно, что число делений, доступных клетке, имеет предел — как у абонемента с фиксированным числом поездок. У клеток, израсходовавших значительную часть таких «поездок», то есть делившихся снова и снова, появляются изменения морфологии: уплощение (распластывание по поверхности) и увеличение размера. Это одна из характеристик, сопровождающих клеточное старение (replicative senescence).
При производстве секретома (совокупности компонентов, выделенных клетками в ходе культивирования) эта морфология имеет практическое значение. Приготовьте блюдо по одному и тому же рецепту из продуктов в разном состоянии — результат выйдет разным; точно так же, если состояние исходных клеток меняется от партии к партии, состав собираемых секретируемых компонентов труднее выдержать однородным.
Главное
Размер клеток — объективный показатель, который у любого измеряющего получается одинаковым. Мы измеряем и фиксируем его как один из критериев при определении момента сбора.
2. Данные измерений — диаметр 22.3 μm и 14.9 μm
Сначала результат. Клетки после 30 дней культивирования в стандартной среде имели диаметр 22.3 μm, а после 20 дней в собственной среде — 14.9 μm. Ниже — реальные клетки, снятые в счётной камере (приборе для подсчёта клеток под микроскопом) при одинаковом увеличении.
Диаметр клеток 22.3 ± 0.75 μm
Диаметр клеток 14.9 ± 0.21 μm
Слева размеры неодинаковы, видны объекты с нарушенными контурами и скопления. Справа округлые клетки распределены равномерно. Знак «±» при значениях обозначает стандартную ошибку среднего (SEM).
Разница в 1.5 раза по диаметру в пересчёте на объём даёт примерно 3.4 раза — различие заметно больше, чем кажется по самим числам.
Главное
Увеличьте диаметр воздушного шара в 1.5 раза — воздуха внутрь войдёт в кубе больше, примерно в 3.4 раза. С клетками так же: «диаметр в 1.5 раза» — это примерно 3.4 раза по содержимому. Цифру диаметра нужно читать в пересчёте на объём.
3. Откуда берётся разница — дни до достижения нужного числа клеток
Сразу к сути: разницу создаёт число дней, необходимых для достижения нужного количества клеток. Особой обработки, которая останавливала бы само увеличение размера, не существует.
Возможность получить нужное число клеток за более короткий период культивирования означает, что сбор проводится до того, как увеличение размера зайдёт далеко. Если добраться до той же точки на десять дней раньше, собранные клетки будут настолько же «моложе».
Главное
Это не технология, которая останавливает старение, а технология, которая сокращает ожидание. С самими клетками не делают ничего особенного — разницу в диаметре, показанную на рис. 1, создаёт то, что до сбора требуется меньше дней.
Ход пролиферации
Разница в скорости видна и по промежуточным точкам. Ниже — снимки фазово-контрастной микроскопии на 6-й и 10-й день культивирования; в каждой паре слева стандартная среда, справа собственная.
6-й день культивирования
10-й день культивирования
При сравнении на один и тот же день культивирования хорошо видна разница в скорости заполнения поля зрения. К 10-му дню в собственной среде клетки покрывают почти всю площадь.
4. Подтверждение помимо морфологии — поверхностные маркеры
Сразу к сути: независимое от морфологии измерение показывает разницу в ту же сторону. В оценку по снимкам легко вносится субъективность, поэтому мы измеряем также поверхностные маркеры, применяемые для идентификации мезенхимальных стволовых клеток (стволовых клеток, способных превращаться в костную, жировую и другие ткани).
| Показатель | Среда другой компании | Собственная среда | Критерий |
|---|---|---|---|
| Жизнеспособность | 97.2% | 99.1% | Чем выше, тем лучше |
| CD44 | 100% | 100% | Положительный |
| CD73 | 99.5% | 100% | Положительный |
| CD90 | 99.2% | 100% | Положительный |
| CD105 | 85.3% | 99.2% | Положительный |
| HLA-ABC | 98.6% | 98.6% | Положительный |
| CD31 | 0.6% | 0.5% | Отрицательный |
| CD45 | 0.3% | 0.2% | Отрицательный |
| HLA-DR | 0.3% | 0.4% | Отрицательный |
Разделение на положительные и отрицательные маркеры соответствует минимальным критериям для мезенхимальных стволовых клеток, предложенным Международным обществом клеточной терапии (ISCT).
Заметнее всего различие по CD105: с 85.3% до 99.2%, то есть на 13.9 процентного пункта. CD105 — маркер, о снижении которого при многократных пассажах (разделении размножившихся клеток и их пересеве) известно из литературы. Это другая линейка, нежели размер клеток, но указывает она в ту же сторону.
Остальные положительные маркеры изначально высоки, и разница невелика. Отрицательные маркеры в обоих случаях достаточно низкие: только по HLA-DR значение в собственной среде немного выше, но оба показателя меньше 1%.
5. Как читать эти данные — три оговорки
У этих данных есть три условия, о которых читателю стоит знать. Ради полноты картины укажем их сразу.
- Это не контролируемый эксперимент в одной временной точке. Стандартная среда — эквивалент 100 млн клеток за 30 дней, собственная среда — эквивалент 500 млн клеток за 20 дней: различаются и число дней культивирования, и достигнутое число клеток. На вопрос «что будет, если уравнять число дней» эти данные ответа не дают
- «Продукт другой компании», взятый для сравнения, не раскрывается. Это не то сравнение, которое третья сторона могла бы воспроизвести в тех же условиях
- Знак «±» при диаметре клеток обозначает стандартную ошибку среднего (SEM)
С учётом этого статья описывает управление состоянием исходных клеток в производственном процессе. Цель — фиксировать размер клеток на момент сбора и выдерживать его одинаковым от партии к партии. Это не данные о превосходстве по лечебному эффекту.
Мы принимаем заказы на контрактное культивирование
Показанные здесь питательная среда и технология культивирования применяются не только при производстве нашей продукции: они доступны и в формате контрактного культивирования. Мы принимаем запросы на наращивание клеток в условиях без компонентов животного происхождения и на выравнивание состояния клеток на момент сбора.
- Что мы выполняем
- Наращивание культуры мезенхимальных стволовых клеток, консультации по условиям культивирования, измерение числа клеток, диаметра клеток и поверхностных маркеров
- Условия культивирования
- Чистое помещение класса 10 000 на производстве в Гиндзе, бокс биологической безопасности класса 100
- Питательная среда
- Собственная среда без сырья животного происхождения, бессывороточная и безбелковая
- Порядок обращения
- После уточнения типа клеток, требуемого объёма и сроков сообщим о возможности выполнения и предоставим расчёт стоимости
В отдельных случаях мы не сможем принять заказ, поэтому сначала свяжитесь с нами. Выберите в форме обращения пункт «Консультация по контрактному культивированию», и наш сотрудник свяжется с вами.
Обсудить контрактное культивирование
О различии между кондиционированной средой и секретомом читайте в статье Чем кондиционированная среда стволовых клеток отличается от секретома.
Часто задаваемые вопросы
Чем плохо, что клетки становятся крупнее?
Уплощение и увеличение размера клеток описаны как изменения морфологии, наблюдаемые у клеток после многократных делений. Если состояние исходных клеток меняется от партии к партии, состав собираемых секретируемых компонентов труднее выдержать однородным. Мы фиксируем размер клеток как один из критериев при принятии решения о сборе.
Насколько велика разница, если диаметр отличается в 1.5 раза?
Если считать клетку шаром, объём пропорционален кубу диаметра. При диаметрах 22.3 μm и 14.9 μm отношение диаметров составляет около 1.50, а отношение объёмов — около 3.4.
Можно ли заказать контрактное культивирование?
Да, принимаем. Мы выполняем наращивание культуры (процесс увеличения числа клеток до необходимого количества) в условиях без компонентов животного происхождения, а также измерение числа клеток, диаметра клеток и поверхностных маркеров. В зависимости от типа клеток, требуемого объёма и сроков мы можем не принять заказ, поэтому обратитесь к нам через форму обращения, выбрав пункт «Консультация по контрактному культивированию».
Раскрываются ли данные о составе?
Для каждой производственной партии мы измеряем содержание цитокинов и количество miRNA в экзосомах и по запросу предоставляем сертификат анализа. Подробнее — в разделе Система безопасности.
Настоящая статья описывает способ производства продукции и управление её качеством. Наш секретом стволовых клеток поставляется как реагент для научных исследований и не предназначен для демонстрации эффективности при каких-либо заболеваниях.
Источники и первичная литература
- Минимальные критерии для мезенхимальных стромальных клеток: Dominici M, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317. (Основание для разделения поверхностных маркеров на положительные и отрицательные)
- Изменения морфологии при клеточном старении: Wagner W, et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS ONE. 2008;3(5):e2213. (Сообщение об увеличении и уплощении клеток при серийном пассировании)
- Данные измерений: приведённые в статье значения диаметра клеток, ход пролиферации, поверхностные маркеры, показатели жизнеспособности и микрофотографии получены по нашим собственным измерениям.
Спецификация секретома стволовых клеток Консультация по контрактному культивированию