Суть статьи за 30 секунд
- Кондиционированную среду собирают целиком, вместе с жидкостью. Рядом с целевыми компонентами в ней оказываются сыворотка животного происхождения, добавленные факторы и клеточный дебрис.
- Секретом устроен так, чтобы примеси в него не попадали. Его получают не удалением постфактум, а средой и процессом, которые изначально не вносят посторонние компоненты: в жидкости не остаётся ничего, кроме секретированного клетками.
- Разница видна в том, насколько легко всё объяснить. От партии к партии меняется меньше факторов, а происхождение каждого компонента выводится из самой технологии производства.
1. Главный вывод — удалить потом или не вносить вовсе
Сразу к сути. Кондиционированная среда — это питательная среда, собранная целиком после культивирования стволовых клеток. Рядом с компонентами, которые секретировали клетки, в ней находятся составляющие использованной среды (компоненты животного происхождения, например бычья сыворотка, и добавленные факторы), а также клеточный дебрис и аммиак, образовавшиеся за время культивирования.
Секретом, напротив, состоит только из компонентов, секретированных клетками. Разделяет эти два продукта не техника очистки после сбора, а устройство питательной среды и процесса культивирования, при котором посторонние компоненты вообще не вносятся.
Главное
Если перейти на кулинарный язык, кондиционированная среда — это готовая кастрюля, с которой лишнее снимают ложкой, а секретом — блюдо, собранное с самого начала на прозрачном бульоне. Снять ложкой то, что уже растворилось в жидкости, не получится.
2. Что примешано к кондиционированной среде
Суть одна. При обычной технологии всё, что добавили ради роста клеток, переходит прямо в продукт.
При обычном культивировании мезенхимальных стволовых клеток (стволовых клеток, способных превращаться в костную, жировую и другие ткани) используется питательная среда с эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), которая поддерживает рост клеток. При сборе кондиционированной среды вместе с нужными секретируемыми компонентами в неё попадает следующее.
- Факторы из питательной среды: белки, РНК и другие составляющие бычьей сыворотки
- Добавленные факторы: компоненты, внесённые для стимуляции роста клеток
- Ненужные вещества клеточного происхождения: погибшие клетки, клеточный дебрис, аммиак как продукт метаболизма
Всё это не относится к целевым компонентам продукта. Их количество меняется в зависимости от условий культивирования и от партии, поэтому они становятся источником разброса состава.
3. Вариант «удалить потом» и его предел
Сразу вывод: удаление после сбора — шаг вперёд, но у него есть принципиальный потолок: компоненты, близкие по свойствам к целевым, разделить до конца не удаётся.
Посторонние компоненты действительно можно удалять уже после сбора: ультрафильтрация, эксклюзионная хроматография (разделение компонентов по размеру) и другие способы разделения по молекулярной массе. По сравнению с необработанной кондиционированной средой это шаг вперёд с точки зрения безопасности.
Однако полное разделение даётся непросто. В отношении РНК, происходящей из эмбриональной телячьей сыворотки, сообщалось, что она мешает анализу внеклеточной РНК культивируемых клеток [1]. Чем ближе свойства целевых и посторонних компонентов, тем труднее их разделить.
Главное
Разделять постфактум — всё равно что выбирать крупинки соли из белого песка. То, что схоже и по виду, и по размеру, до конца не переберёшь, как ни старайся. У подхода «удалить потом» есть предел, заложенный самим принципом. Подробно эта проблема разобрана в статье РНК бычьей сыворотки нельзя удалить «потом» полностью.
Если поставить три способа рядом, картина получается такой.
| Показатель | Кондиционированная среда | Среда после очистки | Секретом стволовых клеток |
|---|---|---|---|
| Безопасность | Уровень 1 из 3 (компоненты среды остаются) | Уровень 2 из 3 (снижены за счёт очистки) | Уровень 3 из 3 (изначально отсутствуют) |
| Факторы из питательной среды | Много | Удаляются после культивирования | Отсутствуют |
| Добавленные факторы | Много | Удаляются после культивирования | Отсутствуют |
| Бычья сыворотка | Используется | Используется (затем удаляется) | Не используется |
| Принцип | — | Удалять постфактум | Не вносить изначально |
Безопасность оценена по трём уровням: △ < ○ < ◎. Учитывается, сколько остаётся компонентов питательной среды и добавленных факторов.
4. Шесть условий, при которых мы называем препарат секретомом
Мы называем «секретомом» только то, что отвечает всем шести условиям ниже. Их же удобно использовать как список для последовательной проверки.
-
Состоит только из компонентов, секретированных клетками или тканью
Жидкость, в которой есть и компоненты из питательной среды, под это определение не подходит.
-
В среде для сбора не остаётся цитокинов (белков, передающих сигналы между клетками) и факторов роста
Если в среде для сбора есть факторы роста (белки, стимулирующие рост и восстановление клеток), различить, что из содержащихся в продукте факторов роста секретировали клетки, а что изначально было в среде, невозможно. Становится неясно, что означают цифры в спецификации состава.
-
Содержит белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и мембранные везикулы, в том числе экзосомы (мельчайшие мембранные пузырьки, выделяемые клетками)
Требование здесь в том, чтобы это была вся совокупность секретированного клетками.
-
Не содержит примесей: аммиака, вредных веществ вроде тяжёлых металлов, погибших клеток
Метаболиты, образующиеся при культивировании, и ненужные вещества клеточного происхождения в готовый препарат не переносятся.
-
Не используется бычья сыворотка
Пока применяется бычья сыворотка, сколько бы стадий очистки ни было проведено, полностью исключить остатки её компонентов нельзя. Отказ от неё делает объяснение самым простым.
-
Состав подтверждён данными (количественное определение белка, измерение основных цитокинов, анализ экзосом и другое)
Важно не просто заявить определение, а показать его измеренными данными.
На практике особенно заметно сказываются пункты 2 и 5. Оба напрямую определяют, можно ли объяснить цифры в спецификации состава через происхождение компонентов.
Эти шесть пунктов, переработанные в список вопросов поставщику, собраны в статье Как выбирать кондиционированную среду и секретом. Этот список пригодится при сравнении предложений.
5. Что это меняет для медицинского учреждения
В повседневной работе разница в технологии проявляется как меньший разброс и более простое объяснение. Конкретно — в трёх вещах.
Меньше разброс состава
Компоненты питательной среды в продукт не попадают, поэтому число факторов, меняющихся от партии к партии, сокращается. Мы измеряем содержание цитокинов и количество miRNA в экзосомах для всех партий и раскрываем результаты.
Происхождение компонентов можно объяснить
На вопрос «откуда взялся этот компонент» можно ответить, опираясь на технологию производства. Там, где обращение с препаратом приходится фиксировать и объяснять, возможность проследить происхождение стоит немало.
Проще объяснять ситуацию с компонентами животного происхождения
Бычья сыворотка не используется, поэтому на вопросы о компонентах животного происхождения можно отвечать не степенью их удаления, а словами «мы её не применяем».
Определение самой кондиционированной среды и чтение спецификаций разобраны в статье Что такое кондиционированная среда стволовых клеток, общая картина понятия «секретом» — в статье Что такое секретом, а виды сред, построенных по принципу «не добавлять», — в статье Дизайн среды «без добавок».
Часто задаваемые вопросы
Является ли секретом разновидностью кондиционированной среды?
В широком смысле и то и другое получают из жидкости, в которой культивировали клетки. Однако мы называем секретомом только то, что отвечает всем шести условиям из этой статьи. На рынке этот термин иногда используют шире, поэтому при покупке рекомендуем уточнять определение и наличие данных о составе.
Чем это отличается от продуктов, в которых выделены только экзосомы?
Помимо экзосом, секретом содержит растворимые факторы (компоненты, которые действуют в растворённом виде) — цитокины и факторы роста. Продукты, в которых выделены только экзосомы, растворимых факторов не содержат.
Раскрываете ли вы данные о составе?
Для каждой производственной партии мы измеряем содержание цитокинов и количество miRNA в экзосомах и по запросу предоставляем сертификат анализа и данные о составе. Подробнее — в разделе Система безопасности.
Эта статья описывает способ производства продукта и контроль качества. Секретом стволовых клеток нашей компании поставляется как реагент для научных исследований и не предназначен для демонстрации эффективности при каких-либо заболеваниях.
Источники
- [1] Wei Z, Batagov AO, Carter DR, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Rep. 2016;6:31175. doi:10.1038/srep31175