Суть статьи за 30 секунд
- Кондиционированная среда — это не «жидкость из экзосом». Это вся жидкость, которая остаётся после удаления клеток, а экзосомы — лишь часть её содержимого.
- Препаратов с регистрационным одобрением нет ни в Японии, ни за рубежом. Поставщик может представить не эффективность, а результаты измерения качества.
- Один только источник (жировая ткань, пульпа молочных зубов, пуповина) качества не определяет. Факторов, порождающих разброс качества, выделено девять, и источник — лишь один из них.
1. Что такое кондиционированная среда — это не «жидкость из экзосом»
Сразу к выводу: кондиционированная среда стволовых клеток — это вся жидкость, которая остаётся после культивирования стволовых клеток, когда сами клетки удалены. По-английски её называют conditioned medium (CM), а среду, полученную от мезенхимальных стволовых клеток (стволовых клеток, способных превращаться в костную, жировую и другие ткани), обозначают как MSC-CM.
Кулинарная аналогия: по устройству это близко к бульону, из которого вынули водоросли комбу. Самих водорослей — то есть клеток — в жидкости уже нет, но вышедшие из них вещества растворены по всему объёму.
Содержимое делится на две большие группы.
- Растворимые факторы — белки, нуклеиновые кислоты, липиды и другие компоненты, которые работают в растворённом виде.
- Внеклеточные везикулы — выделяемые клетками мельчайшие пузырьки, окружённые мембраной (собирательное название, включающее экзосомы). По сути это маленькие капсулы, в которых вещества упакованы под мембрану.
Главное
«Кондиционированная среда» и «экзосома» — не синонимы. Среда — это вся жидкость, которая может содержать везикулы, но самими везикулами она не является. С этого различия начинается чтение любых материалов о продукте.
Отношения включения между кондиционированной средой, секретомом и экзосомами разобраны на схеме в статье Что такое секретом.
2. Каково положение в законодательстве Японии — препаратов с одобрением нет
Здесь два момента. Препаратов с регистрационным одобрением не существует, а большинство сценариев применения остаётся вне экспертизы по Закону о безопасности регенеративной медицины. Если понять это неверно, то и смысл спецификаций будет прочитан неправильно.
Препаратов с регистрационным одобрением не существует
Министерство здравоохранения, труда и благосостояния Японии в административном уведомлении от 31 июля 2024 года прямо указало следующее[1].
На настоящий момент ни в Японии, ни за рубежом нет лекарственных препаратов на основе применяемых экзосом и подобных продуктов, для которых были бы показаны эффективность и безопасность и которые получили бы регистрационное одобрение и производились бы для продажи.
Из административного уведомления Отдела политики исследований и разработок Бюро политики здравоохранения Министерства здравоохранения, труда и благосостояния Японии (31 июля 2024 г.)Обратите внимание на формулировку: не просто «в Японии нет», а нет «ни за рубежом». Поэтому, если в материалах заявляется об эффективности, это уже само по себе повод усомниться в их содержании. Поставщик может представить не эффективность, а результаты измерения качества.
Они не подпадают под Закон о безопасности регенеративной медицины
Медицинские процедуры с внеклеточными везикулами и кондиционированной средой, которые готовят по указанию врача или стоматолога и применяют у пациентов той же клиники, не подпадают под действующий Закон о безопасности регенеративной медицины[2]. Они не проходят рассмотрение в аккредитованном комитете по регенеративной медицине.
Речь не о том, что регулирование мягче, а о том, что здесь нет третьей стороны, которая провела бы экспертизу. Это похоже на поставку без приёмочного контроля: вскрывать упаковку и проверять приходится тому, кто получает. Руководство Японского общества регенеративной медицины прямо указывает: ответственность за понимание качества и рисков несёт сам врач или стоматолог, оказывающий услугу.
Главное
Препаратов с одобрением нет, экспертизы третьей стороны тоже нет. Значит, ответственность за проверку качества лежит на том, кто читает материалы. Проверка на этапе выбора сырья тем самым становится последним рубежом.
Отметим, что в переходные положения закона о поправках, обнародованного в июне 2024 года, включено требование рассмотреть вопрос о медицинских технологиях с использованием продуктов клеточной секреции — ориентировочно в течение двух лет после вступления поправок в силу. Регулирование продолжает меняться.
3. Как читать спецификацию — национальное руководство как мерило
Спецификацию читают не в поисках чисел побольше, а сверяя с руководством, что именно было измерено. В апреле 2024 года Японское общество регенеративной медицины при участии Японского общества по внеклеточным везикулам опубликовало «Руководство по клиническому применению внеклеточных везикул и подобных продуктов (издание 1)»[2]. В нём указано, что следует приводить в спецификации препарата.
Руководство требует двух доказательств
Вывод прост: нужны и «наличие частиц», и «наличие маркеров». В качестве показателей, обычно включаемых в спецификацию, названы два.
- наличие частиц, имеющих форму и размер внеклеточных везикул
- наличие маркерных молекул внеклеточных везикул
В качестве маркерных молекул названы тетраспанины (CD9, CD63, CD81 и другие) и факторы, связанные с поздними эндосомами (Tsg101, Alix и другие). Международный программный документ указывает, что таких белков следует проанализировать полуколичественно не менее трёх.
То есть одного «частицы обнаружены» недостаточно, как недостаточно и одного «маркеры присутствуют». Нужно и то, и другое.
Число частиц и количество белка читают в сопоставлении
Руководство отмечает, что при введении часто пользуются числом частиц и количеством белка, и добавляет: «желательно, чтобы между этими величинами была корреляция».
Показать крупно только одно из двух чисел вполне возможно. Расхождение между ними даёт основание предположить, что подсчитано что-то помимо частиц либо что доля белков невезикулярного происхождения велика.
Главное
В спецификации в первую очередь смотрят, приведены ли число частиц и количество белка вместе и сходятся ли они между собой. Материалы, где крупно напечатано лишь одно из двух чисел, больше ничего сообщить не могут.
Концентрация белка — это не «количество действующего вещества»
Значение общего белка — это, образно говоря, вес, взятый вместе с кастрюлей. В него входят компоненты, происходящие из питательной среды, поэтому это не то количество, которое выделили клетки. Кроме того, для концентрированных образцов описано завышение результатов измерения из-за сопутствующих примесей.
Прочтение «высокая концентрация белка = много действующего вещества» несостоятельно.
Об эндотоксине нельзя судить в отрыве от дозы
Допустимое значение эндотоксина (вещества бактериального происхождения, вызывающего лихорадку) не задаётся абсолютной величиной. Его, как и дозу лекарства, рассчитывают от вводимого количества. Для парентеральных препаратов пирогенным порогом принимают 5.0 EU на 1 кг массы тела в час; предельное значение получают, разделив эту величину на максимальный объём, который может быть введён за час.
Поэтому одна лишь надпись «не более 0.1 EU/mL» не даёт оснований для суждения о безопасности. Смысл она приобретает только вместе с тем, какой объём и каким образом предполагается применять.
Что именно выявляют и чего не выявляют испытание на стерильность, тест на микоплазму и испытание на эндотоксины, разобрано в статье Испытания безопасности кондиционированной среды.
Замечания об исходных материалах — не используется ли сыворотка
Руководство указывает, что следует применять питательную среду xeno-free, не содержащую компонентов животного происхождения. Отмечено, что при использовании эмбриональной телячьей сыворотки в продукт попадают внеклеточные везикулы бычьей сыворотки, что может привести к проявлению непредвиденной биологической активности.
Среди веществ, вызывающих опасения, конкретно перечислены альбумин, фибриноген, фибронектин, аполипопротеин B, макроглобулин, гемоглобин, факторы свёртывания крови и другие.
4. Как относиться к различиям между источниками (жировая ткань, пульпа молочных зубов, пуповина)
Сразу к выводу: различия на уровне клеточной биологии описаны, но исследований, сравнивающих действие у человека, не существует. Этот вопрос нам задают часто, поэтому приводим описанные факты как есть.
| Аспект | Что сообщается |
|---|---|
| Состав секретируемых факторов | В исследовании, где среды пуповинного и пульпарного происхождения сравнивали в одинаковых условиях, описано различие: HGF выше в пуповинном варианте, VEGF-A — в пульпарном[3] |
| Тенденции экспрессии генов | Есть сообщения о том, что при пульпарном происхождении относительно выше экспрессия группы нейротрофических факторов, а при жировом — группы факторов, связанных с ангиогенезом. Однако это различие на уровне экспрессии генов, а не различие клинического действия[4] |
| Разброс между донорами | При анализе 71 донора ткани пуповины клетки были получены во всех случаях, скорость пролиферации и соответствие критериям поверхностных антигенов оставались стабильными. Поскольку материал неонатального происхождения, влияние возраста донора, значимое для тканей взрослых, здесь не проявляется[5] |
| Возраст донора | С одной стороны, есть систематический обзор, согласно которому старение усиливает клеточное старение; с другой — сообщение о том, что в бессывороточной среде между 30 и 60 годами не было различий в пролиферативной способности и в способности к костной и хрящевой дифференцировке. Условия культивирования выступают конфаундером, поэтому упрощать картину нельзя |
Расписывать области применения по источникам в этой статье мы не будем. Основанием служат главным образом экспрессия генов и количественное определение цитокинов в пробирке, а исследований, сравнивающих действие у человека, не существует. Указывать на показания и эффективность продукта, не получившего одобрения, статья 68 Закона о фармацевтике и медицинских изделиях запрещает любому лицу.
5. Качество определяют девять факторов — источник лишь один из них
В обзорной работе выделены девять факторов, порождающих разброс качества секретома[6]. Источник — лишь один из этих девяти.
- Исходная ткань
- Характеристики донора (возраст, пол, метаболический статус, заболевания)
- Число пассажей (сколько раз культуру пересевали)
- Состав питательной среды и применение сыворотки
- Плотность клеток и время сбора секретируемых компонентов
- Условия культивирования (трёхмерная культура, гипоксия, механическая стимуляция)
- Способ очистки
- Масштаб производства и оборудование
- Условия хранения и транспортировки
Если взять аналогию с кофе, источник — это регион происхождения зёрен. Как из зёрен одного региона получается разный напиток в зависимости от обжарки и способа заваривания, так и при одном и том же источнике другая питательная среда и другой технологический процесс дают другой продукт. Прежде чем сравнивать источники, содержательнее посмотреть на способ производства и спецификацию.
Различия в остаточных компонентах в зависимости от способа производства разобраны в статье Чем кондиционированная среда стволовых клеток отличается от секретома, а вопросы к поставщику собраны в статье Шесть пунктов, которые стоит уточнить у поставщика.
Часто задаваемые вопросы
Кондиционированная среда и экзосома — это одно и то же?
Нет. Кондиционированная среда — это вся жидкость, которая остаётся после культивирования клеток, когда сами клетки удалены. Её содержимое делится на две группы: растворимые факторы, растворённые в жидкости, и внеклеточные везикулы (мембранные пузырьки, включая экзосомы). Экзосома — лишь один из компонентов, содержащихся в среде, а не сама среда.
Подпадает ли кондиционированная среда под Закон о безопасности регенеративной медицины?
Если её готовят по указанию врача или стоматолога и применяют у пациентов той же клиники, под действующий закон она не подпадает. Рассмотрение в аккредитованном комитете по регенеративной медицине не проводится. Поэтому руководство Японского общества регенеративной медицины прямо указывает, что ответственность за понимание качества и рисков несёт сам врач или стоматолог, оказывающий услугу. Отметим, что в законе о поправках, обнародованном в июне 2024 года, переходные положения предусматривают рассмотрение этого вопроса ориентировочно в течение двух лет после вступления поправок в силу.
Какой источник выбрать?
Оснований, достаточных для того, чтобы разграничить применение по назначению, на сегодня нет. Сообщается о различиях в составе секретируемых факторов и о тенденциях экспрессии генов в пробирке, а исследований, сравнивающих действие у человека, не существует. Факторов, порождающих разброс качества, выделено девять, и источник — лишь один из них. Для сравнения содержательнее сначала посмотреть на состав питательной среды, технологический процесс и перечень испытаний.
Источники
- [1] Отдел политики исследований и разработок Бюро политики здравоохранения Министерства здравоохранения, труда и благосостояния Японии. Административное уведомление «О медицинской помощи с использованием кондиционированной среды стволовых клеток, экзосом и подобных продуктов (информирование)», 31 июля 2024 г.
- [2] Японское общество регенеративной медицины (при участии Японского общества по внеклеточным везикулам). «Руководство по клиническому применению внеклеточных везикул и подобных продуктов (издание 1)», 30 апреля 2024 г.
- [3] Caseiro AR, et al. Mesenchymal Stem/Stromal Cells metabolomic and bioactive factors profiles: A comparative analysis on the umbilical cord and dental pulp derived Stem/Stromal Cells secretome. PLoS One. 2019;14(11):e0221378.
- [4] Terunuma A, et al. Comparative transcriptomic analysis of human mesenchymal stem cells derived from dental pulp and adipose tissue. J Stem Cells Regen Med.
- [5] Raileanu VN, et al. Banking Mesenchymal Stromal Cells from Umbilical Cord Tissue: Large Sample Size Analysis Reveals Consistency Between Donors.
- [6] Trigo CM, et al. Towards the Standardization of Mesenchymal Stem Cell Secretome-Derived Product Manufacturing for Tissue Regeneration. Int J Mol Sci. 2023.
Настоящая статья разъясняет терминологию, положение в законодательстве и порядок чтения спецификаций качества. Секретом стволовых клеток нашей компании поставляется как реагент для научных исследований (категория, применение которой ограничено исследовательскими целями; это не лекарственный препарат) и не предназначен для демонстрации эффективности при каких-либо заболеваниях.
Спецификация секретома стволовых клеток Запросить сертификат анализа