Суть статьи за 30 секунд
- Даже после 24 часов ультрацентрифугирования в бычьей сыворотке осталось около 70% РНК. По измерениям удалось удалить лишь 19–33% общей РНК.
- Причина не в мощности прибора, а в принципе метода. Ультрацентрифугирование разделяет, осаждая тяжёлое, поэтому РНК в комплексе с белками — форма, которая не осаждается, — так и остаётся в жидкости.
- Это проблема измерений, а не безопасности. Авторы прямо пишут, что данных о функциональной активности этой РНК в клетках-реципиентах нет; вопрос — в помехах для анализа.
1. Что именно измеряли — проверка в более жёстких условиях, чем обычно
По сути это проверка того, на что реально способна процедура «удалить потом», проведённая в более жёстких условиях, чем принято. Работа опубликована в 2016 году в журнале Scientific Reports[1]. Процедура состояла из трёх шагов.
- Ультрацентрифугировать эмбриональную телячью сыворотку (FBS) при 100,000 g и 4 °C в течение 80 минут, 5 часов или 24 часов.
- После центрифугирования разделить осадок и надосадочную жидкость.
- Измерить общее количество РНК в каждой фракции и сравнить, сколько удалось удалить.
В работе с кондиционированной средой (вся жидкость, которая остаётся после культивирования клеток и удаления самих клеток) известна практика применять сыворотку, из которой везикулы удалены заранее (FBS с удалёнными EV). Это исследование напрямую измерило, насколько полно такая обработка их удаляет.
2. Результат — удалено 19–33%, осталось более двух третей
За 24 часа ультрацентрифугирования удалось удалить 19–33% общей РНК. Иначе говоря, 67–81% осталось в надосадочной жидкости — то есть на стороне FBS с удалёнными EV. В резюме статьи результат сформулирован так.
“The majority of them (>70%) are retained even after extended ultracentrifugation in the preparations of vesicle-depleted FBS”
Бо́льшая часть этой РНК из FBS (более 70%) остаётся в препаратах FBS с удалёнными везикулами даже после продлённого ультрацентрифугирования.
Wei et al. (2016), из резюме статьиПри чтении этой цифры важны две оговорки.
Первое: 24 часа — более жёсткое условие, чем принято. По данным статьи, большинство исследователей получают сыворотку с удалёнными EV ультрацентрифугированием при 70,000–110,000 g в течение 2–18 часов; 24 часа этот диапазон превышают. Значит, при обычной процедуре разумно ожидать, что останется ещё больше.
Второе: измеряли только общее количество РНК. Белки, эндотоксин (пирогенное вещество бактериального происхождения) и прочие примеси не измерялись. Речь не о том, что остаётся 70% примесей в целом: цифра относится только к РНК.
3. Почему удалить всё не удаётся — то, что не осаждается, осадить нельзя
Вывод простой: это предел принципа метода, а не производительности прибора. Ультрацентрифугирование разделяет частицы, осаждая их по массе. Везикулы, заключённые в мембрану, осаждаются; то, что такой формы не имеет, — нет.
Главное
Если оставить мутную воду в покое, песок осядет на дно, но растворённая соль не осядет, сколько ни жди. Ультрацентрифугирование — это то же осаждение, только многократно усиленное. «Песок», то есть везикулы, оно осадить может, а РНК, растворённую в комплексе с белками, — «соль» — не осадит, сколько ни продлевай вращение.
Авторы тоже предполагают, что бо́льшая часть оставшейся РНК присутствует в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (РНК, связанная с белками). Это не везикулы, поэтому метод, рассчитанный на осаждение везикул, по самому своему принципу удаляет их плохо.
По измерениям, из необработанной FBS извлекали 5–40 ng/mL общей РНК, а в препаратах, прошедших удаление EV, оставалось в среднем 34 ng/mL.
4. Что происходит, когда она остаётся, — помехи при анализе
Оставшаяся РНК бычьего происхождения примешивается к результатам измерений на стороне клеток. Одной фразой: перестаёт различаться то, что выделили клетки, и то, что изначально было в питательной среде. В статье показаны три эффекта.
| Явление | Содержание |
|---|---|
| Принимается за РНК человека | В бычьей РНК много эволюционно консервативных последовательностей, которые совпадают с геномом человека. Даже при полном запрете несовпадений 13.2% ридов из надосадочной жидкости картировались на геном человека |
| Принимается за продукт клеток | Характерная для печени miR-122 обнаруживалась в высоком количестве в кондиционированной среде клеток глиомы, не относящихся к печени. Однако в свежей неиспользованной среде её было столько же: источником была среда, а не секреция клеток |
| Примешивается и к внутриклеточным измерениям | miR-1246, гомолога которой у мыши не существует, воспроизводимо выявлялась в линиях мышиных клеток, культивированных на 10% FBS. При переходе на среду с удалёнными EV сигнал значимо снижался |
Все три эффекта сводятся к одному: различие теряется. Читая аналитические данные по кондиционированной среде, приходится спрашивать, действительно ли эта цифра клеточного происхождения.
При этом с той же силой стоит держать в уме, что эта работа не показала проблемы безопасности. В обсуждении авторы пишут прямо:
“As of today, there are no data suggesting the functional activity of this low-level bovine RNA in the recipient cells”
На сегодняшний день нет данных, которые указывали бы на функциональную активность этой бычьей РНК в столь низких количествах в клетках-реципиентах.
Wei et al. (2016), из обсужденияВопрос — в помехах для системы измерений, а не в безопасности. То есть в том, что становится неясно, что именно измеряется. Стоит потерять это различие — и смысл работы будет прочитан неверно.
5. Насколько это можно обобщать — чего работа не показывает
Если сразу к выводу: из этой работы следует лишь утверждение о пределах ультрацентрифугирования, и не более. Три ограничения стоит назвать прямо.
- Проверялось только ультрацентрифугирование. В более поздних исследованиях сообщается, что процедура на основе ультрафильтрации, разделяющей через мембрану, удаляла везикулы эффективнее, чем ночное ультрацентрифугирование или коммерческая сыворотка с удалёнными EV[2]. Обобщение «ни один метод их не удаляет» неверно
- Величина эффекта зависит от экспериментальной системы. Количество РНК, выделяемой клетками, сильно различается, поэтому в одних системах помехи заметны, а в других почти не имеют значения
- Это результаты одной лаборатории на трёх партиях. Различия в марке сыворотки, партии и роторе центрифуги остаются искажающими факторами
По второму пункту авторы пишут сами:
“In some cases, therefore, the anticipated contribution of vdFBS-containing media would be negligible, whereas in others, it may skew the results significantly”
Поэтому вклад среды, содержащей FBS с удалёнными EV, в одних случаях будет пренебрежимо мал, а в других может существенно исказить результаты.
Wei et al. (2016), из обсуждения6. Что это значит для проектирования — «убрать потом» или «не вносить вовсе»
Работа показывает, что у подхода «удалить потом» есть принципиальный остаток, свой у каждого метода. При ультрацентрифугировании остаётся всё, что не осаждается. Смена метода лишь меняет то, что проскакивает: необходимость и дальше измерять, сколько именно удалено, никуда не денется.
Другой путь — не вносить это вовсе. Если бычья сыворотка не используется, то и пути для попадания бычьей РНК просто не существует, и обсуждать степень удаления не приходится.
Главное
Полностью оттереть с пола пролитые чернила трудно, но если чернил в комнату не приносить, оттирать будет нечего. В этом и разница между подходом, который постоянно проверяет, сколько удалось убрать потом, и подходом, который изначально ничего не вносит.
В руководстве Японского общества регенеративной медицины также указано, что следует применять питательные среды без компонентов животного происхождения, а при использовании эмбриональной телячьей сыворотки существует риск попадания везикул бычьей сыворотки и проявления непредвиденной биологической активности[3].
Общая картина подхода «не вносить» изложена в материале Питательная среда, в которую ничего не добавляют, а различия остаточных компонентов в зависимости от способа получения — в материале Разница между кондиционированной средой стволовых клеток и секретомом.
Часто задаваемые вопросы
«Остаётся 70%» — это о примесях в целом?
Нет, эта цифра относится только к общему количеству РНК. В работе измеряли лишь РНК; белки, эндотоксин и прочие примеси не измерялись. По результатам измерений удалено 19–33%, осталось 67–81%, и в резюме статьи это выражено как «более 70%».
Вредна ли для организма оставшаяся РНК бычьего происхождения?
Это исследование этого не показывает. Авторы прямо пишут, что на сегодня нет данных, показывающих, что бычья РНК в столь низких количествах выполняет какую-либо функцию в клетках-реципиентах. Вопрос не в безопасности, а в помехах для результатов измерений: перестают различаться компоненты, выделенные клетками, и компоненты, происходящие из питательной среды.
Значит, РНК бычьего происхождения не удаляется никаким методом?
Так сказать нельзя. В этой работе проверялось только ультрацентрифугирование. В более поздних исследованиях сообщается, что процедура на основе ультрафильтрации, разделяющей через мембрану, удаляла эффективнее, чем ночное ультрацентрифугирование или коммерческая сыворотка с удалёнными EV. Точнее будет сказать, что разные методы пропускают разное.
Источники
- [1] Wei Z, Batagov AO, Carter DR, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Rep. 2016;6:31175. doi:10.1038/srep31175
- [2] Kornilov R, Puhka M, Mannerström B, et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1422674. doi:10.1080/20013078.2017.1422674
- [3] Японское общество регенеративной медицины (при участии Японского общества по внеклеточным везикулам). «Руководство по клиническому применению внеклеточных везикул и подобных продуктов (издание 1)», 30 апреля 2024 г.
Цитаты на английском — дословные выдержки из источника [1]; перевод на русский выполнен нами.
Настоящий материал излагает содержание опубликованных исследований. Секретом стволовых клеток нашей компании (совокупность компонентов, выделенных клетками в ходе культивирования) поставляется как реагент для научных исследований и не предназначен для демонстрации эффективности при каких-либо заболеваниях. Приведённые исследования не проводились на продукции нашей компании.
Спецификация секретома стволовых клеток Питательная среда, в которую ничего не добавляют