Суть статьи за 30 секунд
- «Без сыворотки» и xeno-free — разные оси. Есть среды бессывороточные, но с компонентами бычьего происхождения, — и есть обратные.
- Надпись «мы этого не добавляем» — не гарантия безопасности. Xeno-free допускает сыворотку человека, поэтому риск, связанный с патогенами человека, сохраняется.
- Определения расходятся у разных производителей. При сравнении решает не название категории, а то, насколько далеко удаётся проследить перечень исходного сырья.
1. Каждая из четырёх категорий заявляет, чего в среде нет
Сразу к сути: все четыре категории — это заявления вида «компоненты такого рода мы не добавляем», и ограничивают они разные вещи. Начнём с определений.
| Категория | Что не входит | Что допускается |
|---|---|---|
| Бессывороточная (serum-free) | Сыворотка и плазма как таковые | Компоненты животного и человеческого происхождения помимо сыворотки (альбумин, факторы роста, гормоны и др.) |
| Xeno-free (без ксеногенного сырья) | Компоненты, полученные от животных, кроме человека | Компоненты человеческого происхождения (альбумин сыворотки человека, лизат тромбоцитов человека и др.), рекомбинантные белки |
| Без животных компонентов (ACF / AOF) | Сырьё, непосредственно полученное из тканей и жидкостей животных, включая человека | Рекомбинантные белки (при этом производственный процесс требует отдельной проверки) |
| Известного химического состава (chemically defined) | Компоненты неизвестного состава (сыворотка, гидролизаты, тканевые экстракты) | Компоненты с известной структурой и концентрацией, включая высокоочищенные рекомбинантные белки |
Безбелковая среда — это ещё одна ось: в её составе нет белков и полипептидов. При этом свободные аминокислоты и гидролизаты растительного или дрожжевого происхождения, как считается, допускаются.
2. «Без сыворотки» — это не xeno-free: вопросы разные
На практике именно здесь возникает больше всего недоразумений. Одно понятие не входит в другое. Причина в том, что категории заданы по разным осям.
Главное
Похоже на пару «отечественное» и «без добавок» на этикетке продуктов. Первое отвечает на вопрос о происхождении, второе — о составе: бывает и отечественный продукт с добавками, и импортный без них. Точно так же «без сыворотки» — это про сыворотку как материал, а xeno-free — про биологический вид, от которого получен компонент. По одной надписи вторую не вывести.
Среды, отвечающие только одному из условий, действительно существуют в обе стороны.
- Бессывороточная, но не xeno-free. Сюда относятся составы, где вместо сыворотки добавляют бычий сывороточный альбумин (BSA) или неочищенные белковые фракции бычьего происхождения
- Xeno-free, но не бессывороточная. Среда с добавлением сыворотки человека или лизата тромбоцитов человека может относиться к xeno-free, поскольку не содержит компонентов животных, кроме человека, но бессывороточной она не является, так как использует компоненты сыворотки
Поэтому из надписи «без сыворотки» не следует, что компонентов бычьего происхождения нет. Верно и обратное: из «xeno-free» не следует, что сыворотка не используется.
3. Отказ от добавления — ещё не гарантия безопасности
Здесь легко ошибиться, поэтому скажем прямо. Ни «без сыворотки», ни xeno-free сами по себе не гарантируют безопасность. Эти обозначения — перечень того, что не использовано, а не перечень оставшихся рисков.
Бессывороточная среда может содержать компоненты бычьего происхождения, например бычий сывороточный альбумин. Xeno-free допускает компоненты человеческого происхождения, поэтому риск, связанный с патогенами человека, сохраняется. Так, применительно к лизату тромбоцитов человека обсуждается передача вируса гепатита E и парвовируса B19.
Безопасность оценивается не по тому, что исключено, а отдельно для каждого вида сырья. Название категории может служить отправной точкой проверки, но не выводом.
4. Сами определения различаются у разных производителей
Есть и более неудобное обстоятельство. Единого международного определения у этих терминов нет. Одно и то же название категории у разных производителей охватывает разный круг компонентов.
Например, «без животных компонентов» один производитель определяет как исключение сырья животного и человеческого происхождения, а другой допускает рекомбинантные белки, полученные на животных клеточных линиях. Границы понятия «безбелковая» также различаются у разных поставщиков.
Легко упустить и то, что у сырья есть собственное сырьё. На упаковке хлеба написано «пшеничная мука», но как именно получена эта мука, там уже не сказано, — здесь та же схема. И действительно, даже там, где заявлено отсутствие сырья животного происхождения, встречаются формулировки, которые требуют, чтобы животным не было сырьё первого и второго порядка, но при этом прямо оговаривают, что сырьё третьего порядка может быть получено из тканей животных. И для рекомбинантных белков остаётся возможность применения животного сырья на этапах экспрессии и очистки.
По одной маркировке нельзя понять, что именно исключено. При сравнении мы рекомендуем ориентироваться не на название категории на этикетке, а на перечень исходного сырья, прослеженный настолько далеко, насколько это возможно. Надёжнее всего шаг за шагом выяснять, каково происхождение каждого компонента.
Проверку удобнее вести в таком порядке.
-
Запросите не название категории, а перечень исходного сырья
Определения «-free» расходятся у разных производителей, поэтому по одному названию категории нельзя понять, что именно исключено.
-
Выясняйте происхождение каждого компонента шаг за шагом
Даже для рекомбинантного белка животное сырьё может появиться на этапах экспрессии и очистки. В идеале проверка доходит до сырья третьего порядка.
-
Если остаются компоненты человеческого происхождения, спросите, как их оценивают
Xeno-free допускает сыворотку человека и лизат тромбоцитов человека. Как оценивается риск, связанный с патогенами человека, — отдельный пункт проверки.
5. Что происходит с культурой, если убрать сыворотку
Сразу к сути: результат зависит от состава среды, и «медленнее» получается не всегда. Если просто убрать сыворотку, адгезия и пролиферация снижаются: сыворотка содержит факторы роста и факторы адгезии.
При этом утверждать, что без сыворотки пролиферация обязательно замедляется, нельзя. Есть сообщения о том, что в оптимизированных бессывороточных xeno-free средах время удвоения (время, за которое число клеток удваивается) оказывалось меньше, чем при использовании эмбриональной телячьей сыворотки. Результат сильно зависит от типа клеток и состава среды.
Иными словами, цель не в том, чтобы убрать сыворотку, а в том, обеспечивает ли состав среды работоспособность культуры после её удаления.
6. Что говорит японское руководство
Национальное руководство обращается к этому вопросу прямо. Руководство Японского общества регенеративной медицины указывает, что при получении внеклеточных везикул и подобных препаратов следует использовать xeno-free среду, не содержащую компонентов животного происхождения[1].
Обоснование там вполне конкретное. Отмечается, что при использовании эмбриональной телячьей сыворотки в препарат могут попасть внеклеточные везикулы бычьей сыворотки и проявить непредвиденную биологическую активность. В числе вызывающих опасения веществ прямо перечислены альбумин, фибриноген, фибронектин, аполипопротеин B, макроглобулин, гемоглобин и факторы свёртывания крови.
Наш подход: не удалять потом, а не добавлять с самого начала
Мы с нуля разработали среду без сырья животного происхождения, без сыворотки и без белка. Среда для сбора не содержит белков, поступающих из питательной среды.
В этой схеме нет стадии «удалить потом». Это не заявление о превосходстве. Такой состав нужен для того, чтобы источником всех компонентов продукта были только вещества, выделенные самими клетками.
Главное
Если не нести песок в комнату, спорить о качестве уборки не придётся. Точно так же при составе, где эти вещества не добавляют с самого начала, сам вопрос «сколько удалось удалить» — степень удаления — не возникает. Отличие от схемы «удалить потом» именно в том, встаёт этот вопрос или нет.
О том, что остаётся при удалении постфактум, рассказано в материале РНК бычьей сыворотки не удаляется полностью постфактум, а сравнение трёх ступеней производства — в материале Чем кондиционированная среда стволовых клеток отличается от секретома.
Часто задаваемые вопросы
Если написано «без сыворотки», значит, компонентов бычьего происхождения нет?
Не обязательно. «Без сыворотки» означает отсутствие самой сыворотки и плазмы, а компоненты животного происхождения помимо сыворотки допускаются. Существуют составы, где вместо сыворотки добавляют бычий сывороточный альбумин. Если вам нужно узнать о наличии компонентов бычьего происхождения, спросите отдельно, является ли среда xeno-free.
Значит ли xeno-free, что продукт безопасен?
Это не гарантия безопасности. Xeno-free означает отсутствие компонентов животного происхождения, кроме человеческих; сыворотка человека и лизат тромбоцитов человека при этом допускаются. Поэтому риск, связанный с патогенами человека, сохраняется. Безопасность оценивается не по тому, что исключено, а отдельно для каждого вида сырья.
Существует ли единое определение этих терминов?
Нет. Определения расходятся у разных производителей и в разных публикациях. Например, «без животных компонентов» иногда определяют как исключение в том числе компонентов человеческого происхождения, а иногда допускают рекомбинантные белки, полученные на животных клеточных линиях. Мы рекомендуем ориентироваться не на название категории в маркировке, а на прослеженный перечень исходного сырья.
Источники
- [1] Японское общество регенеративной медицины (при участии Японского общества внеклеточных везикул). «Руководство по клиническому применению внеклеточных везикул и подобных препаратов (1-я редакция)», 30 апреля 2024 г.
Настоящий материал описывает категории питательных сред и особенности производственной схемы. Наш секретом стволовых клеток (совокупность компонентов, выделенных клетками в ходе культивирования) поставляется как реагент для научных исследований и не предназначен для демонстрации эффективности при каких-либо заболеваниях.
Спецификации секретома стволовых клеток Задать вопрос о производстве