30秒速览：本文要点
- 即便超速离心24小时，牛血清中的RNA仍有七成左右残留。实测中能够去除的仅为总RNA量的19〜33%。
- 残留的原因不在设备性能，而在方法本身的原理。超速离心是靠重量使颗粒沉降来分离的方法，因此与蛋白质结合、“不会沉降的形态”的RNA无法被捞出。
- 这是测定的问题，而不是安全性的问题。作者也明确写道，尚无数据表明其在受体细胞中具有功能；争论点在于对分析结果的干扰。
1. 测定的是什么——在比通常更严苛的条件下实测
简单说，这项研究是在比通常更严苛的条件下，测试“事后去除”这一做法究竟有多大实力。论文2016年发表于 Scientific Reports[1]。步骤分三步。
- 将胎牛血清（FBS）在 100,000 g、4℃ 下超速离心。时间设80分钟、5小时、24小时三种条件。
- 离心之后，分为沉降一侧与上清一侧。
- 分别测定两侧的总RNA量，比较究竟去除了多少。
在培养上清液（细胞培养之后除去细胞所剩下的全部液体）这一领域，使用预先去除囊泡的血清（EV去除型FBS）是已知的常规做法。本研究直接测定了这一做法实际能去除到什么程度。
2. 结果——能够去除的只有19〜33%，三分之二以上残留
24小时超速离心所能去除的RNA，占整体的19〜33%。换言之，有67〜81%留在上清一侧，也就是留在了EV去除型FBS之中。论文摘要对这一结果作了如下总结。
“The majority of them (>70%) are retained even after extended ultracentrifugation in the preparations of vesicle-depleted FBS”
它们（FBS来源的RNA）的大部分（超过70%）即便经过长时间超速离心，仍留在EV去除型FBS的制品之中。
摘自 Wei et al. (2016) 摘要解读这一数字时，有两个前提需要先记住。
其一，24小时是比通常更严苛的条件。论文写道，多数研究者以 70,000〜110,000 g、2〜18小时的超速离心来制备EV去除型血清，24小时超出了这一范围。也就是说，按通常的做法，残留量应理解为比这更多。
其二，所测定的只有总RNA量。蛋白质、内毒素（源自细菌的致热物质）以及其他杂质均未被测定。这并不是“杂质整体的70%会残留”，而是仅限于RNA的数字。
3. 为什么无法彻底去除——不沉降的东西，就沉不下去
结论很简单：这不是设备性能的问题，而是方法在原理上的限度。因为超速离心是靠重量使颗粒沉降来加以分离的方法。被膜包裹的囊泡会沉降，而并非这种形态的成分则不会沉降。
直观要点
把泥水静置一段时间，沙子会沉到底部，但溶在水里的盐无论等多久都不会沉下去。超速离心就是把这种“沉淀”加强到极致的操作。囊泡这类“沙子”能被沉下去，而与蛋白质结合、溶在液体中的RNA（盐），无论把时间延长多久也沉不下来。
作者也推测，残留RNA的大部分是以核糖核蛋白复合物（RNA与蛋白质结合的形态）存在的。由于它并非囊泡，用沉降囊泡的方法在原理上就难以将其除去。
就实测值而言，从未经处理的FBS中回收到 5〜40 ng/mL 的总RNA，而经EV去除处理的制品中平均仍残留 34 ng/mL。
4. 残留之后会发生什么——对分析的干扰
残留的牛源RNA会混入细胞一侧的测定结果之中。一句话说，就是“细胞分泌的成分”与“培养基中原本就含有的成分”变得无法区分。论文所指出的有以下3点。
| 现象 | 内容 |
|---|---|
| 被误读为人源 | 牛源RNA中进化上保守的序列较多，会与人类基因组比对一致。即便在完全不允许错配的条件下，上清一侧仍有13.2%的读段比对到了人类基因组 |
| 被误认为细胞来源 | 肝脏特异性的 miR-122，在并非肝来源的胶质瘤细胞培养上清中被高水平检出。但未使用过的新鲜培养基中也含有同等水平，来源并非细胞分泌，而是培养基 |
| 也会混入细胞内的测定 | 小鼠中不存在同源序列的 miR-1246，在以10%FBS培养的小鼠细胞株中被可重复地检出。改用EV去除型培养基后，信号显著下降 |
这三种现象最终都归结为“无法区分”这一点。也就是说，在阅读培养上清液的分析数据时，需要追问那个数字是否真的来自细胞。
另一方面，同样需要以相同分量记住的是，这项研究并未表明存在安全性问题。作者在讨论部分明确写道：
“As of today, there are no data suggesting the functional activity of this low-level bovine RNA in the recipient cells”
截至今日，尚无数据表明这种低水平的牛RNA在受体细胞中具有功能活性。
摘自 Wei et al. (2016) 讨论争论点不在于安全性，而在于对测定体系的干扰。也就是说，会变得不清楚自己究竟测到了什么。若把这一区别弄错，就会误读这项研究的意义。
5. 可以推广到什么程度——这项研究并未表明的事
先说结论：从这项研究能够得出的，仅到“超速离心这一方法的限度”为止。以下把解读上的三点限度明确写出来。
- 接受验证的只有超速离心。后续研究报告，采用以膜过滤分离的超滤方案，比过夜超速离心或市售EV去除型血清更高效地去除了囊泡[2]。“无论哪种方法都去除不了”这样的推广是错误的
- 影响的大小因实验体系而异。由于细胞所分泌的RNA量存在幅度差异，既有干扰明显的体系，也有几乎不成问题的体系
- 这是单一机构、3个批次的结果。血清的品牌、批次以及离心转子的差异，仍作为混杂因素存在
关于第2点，作者本人写道：
“In some cases, therefore, the anticipated contribution of vdFBS-containing media would be negligible, whereas in others, it may skew the results significantly”
因此，含EV去除型FBS的培养基所带来的影响，有时可以忽略不计，有时则可能大幅扭曲结果。
摘自 Wei et al. (2016) 讨论6. 对设计的含义——是“事后去除”，还是“一开始就不引入”
这项研究所表明的是，“事后去除”这一思路，会因方法不同而伴随原理上的遗漏。就超速离心而言，不沉降的形态就会留下来。换一种方法，只是所遗漏的对象随之改变，“究竟去除到了什么程度”仍需持续测定。
另一种设计是一开始就不引入。只要不使用牛血清，牛源RNA混入的途径本身就不存在，也就不会产生讨论去除率的必要。
直观要点
洒在地板上的墨水很难擦得一干二净，但只要不把墨水带进来，擦拭这件事本身就不会发生。这就是“持续验证事后去除到什么程度”的设计，与“一开始就不放进去”的设计之间的差别。
日本再生医疗学会（日本再生医療学会）的指导文件也提出应使用不含动物来源成分的培养基，并指出若使用胎牛血清，可能混入牛血清来源的囊泡，从而表现出非预期的生物活性[3]。
“不引入”这一设计的全貌，整理在“不添加”的培养基设计一文中；不同制法所带来的残留成分差异，整理在干细胞培养上清液与分泌组的区别一文中。
常见问题
所谓“70%残留”，指的是杂质整体吗？
不是，这是仅针对总RNA量的数字。本研究所测定的只有RNA，蛋白质、内毒素及其他杂质均未测定。实测中能够去除的为19〜33%，残留的为67〜81%，论文摘要将其表述为“超过70%”。
残留的牛源RNA对人体有害吗？
本研究并未表明这一点。作者明确写道，目前尚无数据表明这种低水平的牛RNA在受体细胞中具有功能。争论点不在于安全性，而在于对测定结果的干扰，即无法区分细胞分泌的成分与培养基来源的成分。
是否任何去除方法都无法去除牛源RNA？
不能这样说。本研究所验证的仅为超速离心。后续研究报告，采用以膜过滤分离的超滤方案，比过夜超速离心或市售EV去除型血清去除得更为高效。准确的理解是：不同方法所遗漏的对象各不相同。
参考文献
- [1] Wei Z, Batagov AO, Carter DR, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Rep. 2016;6:31175. doi:10.1038/srep31175
- [2] Kornilov R, Puhka M, Mannerström B, et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1422674. doi:10.1080/20013078.2017.1422674
- [3] 日本再生医疗学会（日本再生医療学会，协助：日本细胞外囊泡学会）《关于细胞外囊泡等临床应用的指导（第1版）》2024年4月30日
英文引文摘自参考文献[1]的原文，中文译文由本公司翻译。
本文介绍的是已公开发表的研究内容。本公司的干细胞分泌组（细胞在培养过程中所分泌成分的总和）仅作为研究用试剂供应，不用于证明对任何特定疾病的疗效。文中介绍的研究并非针对本公司产品所做的试验。