30秒速览：本文要点
- 培养上清液是把液体“整体”回收而成。目标成分之中，同时混有牛血清等动物来源成分、添加因子和细胞碎片。
- 分泌组是“一开始就不混入”的设计。不是事后去除，而是用不引入多余成分的培养基与工艺制成，只含细胞分泌出来的成分。
- 差别体现在“说不说得清”上。批次间发生变动的因素减少，成分的来源可以从制法出发加以说明。
1. 结论 — 分界线是“事后去除”还是“一开始就不混入”
先说结论。培养上清液，是把培养干细胞之后的培养液“整体”回收而成的。其中除细胞分泌的成分外，还同时存在培养所用培养基的成分（牛血清等动物来源成分、添加因子），以及培养过程中产生的细胞碎片和氨。
而分泌组指的是其中仅由细胞分泌的成分构成的部分。区分两者的并不是回收之后的纯化技术，而是从源头上就不引入多余成分的培养基与培养工艺设计。
直观要点
用做菜来打比方，从煮好的锅里事后把多余的东西捞出来，是上清液的思路；一开始就只用清汤来做，是分泌组的思路。靠捞取的方式，溶解得很细的东西是捞不干净的。
2. 培养上清液里混着什么
要点只有一个。在一般的制法下，为培养细胞而加入的成分，会原样被带进产品之中。
在一般的间充质干细胞（可分化为骨、脂肪等的干细胞）培养中，为帮助细胞增殖，会使用含胎牛血清（FBS）的培养基。回收上清液时，与目标分泌成分一同混入的还有以下几类。
- 培养基来源因子：牛血清中所含的蛋白质、RNA 等
- 添加因子：为促进细胞增殖而加入的成分
- 细胞来源的多余物：死细胞、细胞碎片，以及作为代谢产物的氨
这些并非产品的目标成分。由于其含量会随培养条件和批次而变动，因此也构成组成波动的原因。
3. “事后去除”这一选择，以及它的局限
先说结论：事后去除是更进一步的做法，但性质相近的成分分不干净，这一点存在原理上的上限。
也有在回收之后去除多余成分的方法。例如超滤和体积排阻色谱（按大小差异筛分成分的方法）等，利用分子量的差异进行分离。与未作任何处理的上清液相比，可以说在安全性方面前进了一步。
不过，完全分离并不容易。关于源自胎牛血清的 RNA，已有报告指出其会干扰培养细胞来源的细胞外RNA的分析[1]。目标成分与多余成分的性质越接近，分离就越困难。
直观要点
事后再来分开，就像要从白砂里把撒进去的盐一粒粒挑出来。外观和大小都相近的东西，无论挑得多仔细都拣不干净。“事后去除”这一思路，在原理上存在上限。这一问题在牛血清来源RNA无法“事后去除”干净中有详细讨论。
把三种制法并列比较，可以整理成下表。
| 项目 | 一般的培养上清液 | 采用去除技术的上清液 | 干细胞分泌组 |
|---|---|---|---|
| 安全性 | 三级评价中的1（培养基来源成分残留） | 三级评价中的2（通过去除而降低） | 三级评价中的3（本就不含） |
| 培养基来源因子 | 含量较多 | 培养后去除 | 不含 |
| 添加因子 | 含量较多 | 培养后去除 | 不含 |
| 牛血清 | 使用 | 使用（其后去除） | 不使用 |
| 设计思路 | — | 事后去除 | 一开始就不加入 |
安全性分为 △ ＜ ○ ＜ ◎ 三个等级，依据培养基来源成分与添加因子的残留程度进行评价。
4. 本公司把产品称为“分泌组”的六项条件
本公司仅把同时满足以下六项的产品称为“分泌组”。它也可以当作逐项确认的检查清单来使用。
-
仅由细胞或组织分泌的成分构成
混有培养基来源成分的液体，不属于这一定义。
-
采集用培养基中不残留细胞因子（承担细胞间信息传递的蛋白质）与生长因子
如果采集用培养基中含有生长因子（促进细胞增殖与修复的蛋白质），就无法区分产品中的生长因子究竟是“细胞分泌的”还是“原本就在培养基里的”。成分表上的数值究竟意味着什么，也会变得含糊。
-
含有蛋白质、肽、核酸，以及外泌体（细胞释放的微小膜性小囊）等膜囊泡
这一条要求它是细胞分泌成分的总体。
-
不含氨、重金属等有害物质，以及死细胞等杂质
即不把培养过程中产生的代谢产物和细胞来源的多余物带进产品之中。
-
不使用牛血清
只要使用牛血清，无论叠加多少去除工序，都无法完全排除其来源成分的残留。选择不使用，才能让可说明性变得最为简单。
-
具备成分方面的数据支持（蛋白质定量、主要细胞因子测定、外泌体分析等）
不只是自称符合定义，而是能用测定数据加以呈现。
在实际操作中尤其起作用的是第2项与第5项。两者都直接关系到：成分表上的数值，能否从“它究竟从何而来”这一来源出发加以说明。
我们已把这六项改写成向供应商提问的清单，整理在培养上清液·分泌组的选择方法中。欢迎在比较选型时参考使用。
5. 对采购方而言，会有哪些改变
制法上的差异，在日常使用中会以“波动更小”与“更容易说明”的形式体现出来。具体有以下三点。
组成的波动减少
由于不含培养基来源的成分，批次间发生变动的因素相应减少。本公司对全部批次测定细胞因子含量与外泌体中的miRNA含量，并公开结果。
可以说明成分的来源
对于“这一成分从何而来”的问题，可以从制法出发作出回答。在需要留存记录或作出说明的场合，能够追溯来源的价值并不小。
关于动物来源成分的说明变得简单
由于未使用牛血清，面对有关动物来源成分的疑虑，可以直接回答“未使用”，而无需以去除率来说明。
培养上清液本身的定义与规格的解读方法，整理在什么是干细胞培养上清液；分泌组这一概念的整体面貌，整理在什么是分泌组；“不添加”的培养基设计有哪些类型，则整理在“不添加”的培养基设计。
常见问题
分泌组是上清液的一种吗？
从广义上说，两者都取自培养细胞后的液体。不过本公司仅将同时满足正文中六项条件的产品称为分泌组。市场上也有对同一词语作更宽泛使用的情形，因此采购时请确认其定义以及是否具备成分数据。
与只提取外泌体的产品有何区别？
分泌组中除外泌体外，还含有细胞因子和生长因子等可溶性因子（以溶解于液体的状态发挥作用的成分）。仅分离外泌体的产品不含可溶性因子。
是否公开成分数据？
我们按生产批次测定细胞因子含量以及外泌体中的miRNA含量，并可应要求提供检验报告与成分数据。详情请参见安全与质量体系。
本文旨在说明产品的生产方法与质量管理。本公司的干细胞分泌组仅作为研究用试剂供应，不用于证明对任何特定疾病的疗效。
参考文献
- [1] Wei Z, Batagov AO, Carter DR, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Rep. 2016;6:31175. doi:10.1038/srep31175