30秒速览：本文要点
- 培养上清液不是「外泌体的液体」。它是除去细胞之后剩下的全部液体，外泌体只是其内容的一部分。
- 包括海外在内，不存在获得药事批准的药品。供应商能够出示的并非有效性，而是品质的测定结果。
- 仅凭来源（脂肪、乳牙牙髓、脐带）无法决定品质。左右品质的因素已梳理为九项，来源只是其中之一。
1. 什么是培养上清液——它不是「外泌体的液体」
先说结论。干细胞培养上清液，指的是干细胞培养结束后、除去细胞本身所剩下的全部液体。英文称为 conditioned medium（CM），源自间充质干细胞（可分化为骨、脂肪等的干细胞）的则记作 MSC-CM。
若以做菜来打比方，其结构接近于捞出海带之后的「高汤」。海带（细胞）本身已不在液中，但从中溶出的成分留在了整锅汤里。
其内容大致分为两类。
- 可溶性因子——蛋白质、核酸、脂质等，以溶解状态发挥作用的成分。
- 细胞外囊泡——细胞释放的、由膜包裹的微小囊袋（包含外泌体在内的统称）。相当于把成分用膜包起来的小胶囊。
直观要点
「培养上清液」与「外泌体」并非同义。上清液是可能含有囊泡的「全部液体」，而不是囊泡本身。这一区分，是阅读一切产品资料时的出发点。
培养上清液、分泌组与外泌体之间的包含关系，已在什么是分泌组一文的图中加以梳理。
2. 在日本是如何定位的——不存在获批的药品
要点有两个。不存在获得药事批准的药品，而且多数使用场景都在《再生医疗等安全性确保法》的审查之外。若在这一点上存有误解去读资料，对规格含义的理解也会随之偏离。
不存在获得药事批准的药品
日本厚生劳动省（厚生労働省）在2024年7月31日的事务联络中作出如下明确表述[1]。
现阶段，包括海外在内，尚不存在以所使用的外泌体等已证明有效性与安全性、并取得药事批准而生产销售的药品。
引自日本厚生劳动省医政局研究开发政策课 事务联络（令和6年〔2024年〕7月31日）这里写的不是「日本没有」，而是「包括海外在内」都没有。因此，若有资料宣称有效性，这本身就构成怀疑其内容的理由。供应商能够出示的并非有效性，而是品质的测定结果。
属于《再生医疗等安全性确保法》的适用对象之外
在医师、牙科医师的指示下配制、并用于本院患者的细胞外囊泡与培养上清医疗行为，不属于现行《再生医疗等安全性确保法》（再生医療等安全性確保法）的适用对象[2]。不接受认定再生医疗等委员会的审查。
这并不是说监管宽松，而是说不存在代为审查的第三方。打个比方，就像一批没有验收员的到货，拆开查验的角色便落回到收货一方。日本再生医疗学会的指导原则也明确写明，提供治疗的医师、牙科医师本人负有掌握品质与风险的责任。
直观要点
既没有获批的药品，也没有第三方审查。也就是说，确认品质的责任落在阅读资料的一方。在选择原料阶段所做的确认，也就成了最后一道防线。
另外，2024年6月公布的修订法在附则中写入了对使用细胞分泌物等的医疗技术，以施行后两年为目标进行研究讨论的内容。制度仍处在变动之中。
3. 如何解读规格——日本国内指导原则这把「尺子」
读规格表，不是去找数字的大小，而是对照指导原则去读「究竟测了什么」。日本再生医疗学会于2024年4月，在日本细胞外囊泡学会（日本細胞外小胞学会）的协助下公布了《细胞外囊泡等临床应用指导原则（第1版）》[2]。其中写明了作为配制物的规格应当出示哪些内容。
指导原则要求的是两点证明
结论很简单，即「颗粒的存在」与「标志物的存在」两者兼备。作为规格通常应设定的项目，文中列举了以下两项。
- 存在具有细胞外囊泡形态与尺寸的颗粒
- 存在细胞外囊泡的标志物分子
关于标志物分子，文中列举了四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81等）以及晚期内体相关因子（Tsg101、Alix等）。国际立场文件则提出，应对此类蛋白至少三种进行半定量分析。
也就是说，只说「观察到了颗粒」不够，只说「检出了标志物」也不够。两者缺一不可。
颗粒数与蛋白量需要对照起来读
指导原则在指出给药时常用颗粒数与蛋白量的同时，写明「两者之间具有相关关系为宜」。
只把其中一个数字做大是可能的。若两者相互矛盾，便可作为线索去怀疑：要么所计数的并非囊泡，要么囊泡以外的蛋白质偏多。
直观要点
看规格表时首先要确认的，是颗粒数与蛋白量是否一并列出、两者是否对得上。只把其中一个数字写得很大的资料，并不包含更多信息。
蛋白浓度并不等于「有效成分的量」
总蛋白的数值，可以说是「连锅一起称的重量」。其中包含来自培养基的成分，并非细胞分泌量本身。此外还有报告指出，在经过浓缩的样品中，受夹杂成分影响，测定值会偏高。
「蛋白浓度高＝有效成分多」这样的解读并不成立。
内毒素若不与给药量配套，就无法判断
内毒素（源自细菌的致热性物质）的允许值无法以绝对值确定。其思路与药物的剂量计算相同，要从给药量反推。非经口制剂以每公斤体重每小时 5.0 EU 作为发热阈值，再除以1小时内可能给药的最大量，得出限度值。
因此仅有「0.1 EU/mL 以下」这样的标示，还不能成为判断安全性的依据。只有与「以多大用量、如何使用」这一前提配套时，才具有意义。
无菌试验、支原体阴性检测、内毒素检测各自能检出什么、又不能检出什么，已在培养上清液的安全性检测中说明。
关于原材料的提示——是否使用了血清
指导原则提出，应使用不含动物源成分的 无异种成分（Xeno-free）培养基。文中指出，若使用胎牛血清，来自牛血清的细胞外囊泡可能混入，从而表现出非预期的生物活性。
作为受关注的物质，文中具体列举了白蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、载脂蛋白B、巨球蛋白、血红蛋白、血液凝固因子等。
4. 如何看待来源（脂肪、乳牙牙髓、脐带）的差异
先说结论：细胞生物学层面的差异确有报告，但并不存在在人体上比较效果的试验。这是我们经常收到咨询的一点，因此把已有报告的事实照原样列成一览。
| 观点 | 已报告的内容 |
|---|---|
| 分泌因子的组成 | 在同一条件下比较脐带来源与牙髓来源上清的研究中，报告了 HGF 在脐带来源中较高、VEGF-A 在牙髓来源中较高的差异[3] |
| 基因表达的倾向 | 有报告指出，牙髓来源中神经营养因子类、脂肪来源中血管新生相关因子类的表达相对较高。但这是基因表达层面的差异，并非临床效果的差异[4] |
| 供体间的差异 | 对71名供体脐带组织的分析显示，全部样本均获得了细胞，增殖速度与表面抗原标准也保持一致。由于来自新生儿，不受成人组织中供体年龄这一问题的影响[5] |
| 供体年龄 | 一方面有系统综述认为增龄会推进细胞衰老，另一方面也有报告指出，在无血清培养基中30〜60岁之间的增殖能力与成骨、成软骨分化能力并无差异。由于培养条件构成混杂因素，不能作简单化处理 |
按来源分别写明用途的做法，本文不予采用。其依据主要是体外的基因表达与细胞因子定量，并不存在在人体上比较效果的试验。对于未获批准的产品，暗示其功效、效果的表述，依据日本《药机法》（薬機法）第68条对任何人均予禁止。
5. 左右品质的因素有九项——来源只是其中之一
综述中梳理了导致分泌组品质出现波动的九项因素[6]。来源只是这九项中的一项。
- 来源组织
- 供体的特性（年龄、性别、代谢状态、疾病）
- 传代次数（传代培养了多少次）
- 培养基的组成与血清的使用
- 细胞密度，以及采集分泌成分的时间
- 培养环境（三维培养、低氧、力学刺激）
- 纯化的方法
- 生产的规模与设备
- 保管与运输的条件
若以咖啡来打比方，来源相当于「豆子的产地」。同一产地的豆子，因烘焙与冲煮方式不同也会成为另一杯咖啡；同样，来源相同，只要培养基与工艺不同，产物就会不同。与其比较来源，不如先看制法与规格，来得更为实在。
制法带来的残留成分差异，已在干细胞培养上清液与分泌组的区别中说明；应向供应商确认的事项，则汇总在应向供应商确认的6个项目。
常见问题
培养上清液与外泌体是同一种东西吗？
不是。培养上清液是细胞培养结束后除去细胞所剩下的全部液体，其内容大致分为溶解在液体中的可溶性因子，以及细胞外囊泡（包含外泌体在内的膜囊袋）两类。外泌体是上清液所含成分之一，并不等于上清液本身。
培养上清液属于《再生医疗等安全性确保法》的适用对象吗？
在医师、牙科医师的指示下配制并用于本院患者的情形，不属于现行法的适用对象，不接受认定再生医疗等委员会的审查。因此日本再生医疗学会的指导原则明确写明，提供治疗的医师、牙科医师本人负有掌握品质与风险的责任。另外，2024年6月公布的修订法在附则中写入了以施行后两年为目标进行研究讨论的内容。
应当选择哪种来源？
目前尚无足以给出按用途区分使用的依据。已有报告的只是体外分泌因子的组成差异与基因表达的倾向差异，并不存在在人体上比较效果的试验。导致品质波动的因素已梳理为九项，来源只是其中之一。先行确认培养基的设计、生产工艺与检测项目，在比较上更为实在。
参考文献
- [1] 日本厚生劳动省医政局研究开发政策课《关于使用干细胞培养上清液及外泌体等的医疗（周知）》事务联络，令和6年（2024年）7月31日
- [2] 日本再生医疗学会（协助：日本细胞外囊泡学会）《细胞外囊泡等临床应用指导原则（第1版）》2024年4月30日
- [3] Caseiro AR, et al. Mesenchymal Stem/Stromal Cells metabolomic and bioactive factors profiles: A comparative analysis on the umbilical cord and dental pulp derived Stem/Stromal Cells secretome. PLoS One. 2019;14(11):e0221378.
- [4] Terunuma A, et al. Comparative transcriptomic analysis of human mesenchymal stem cells derived from dental pulp and adipose tissue. J Stem Cells Regen Med.
- [5] Raileanu VN, et al. Banking Mesenchymal Stromal Cells from Umbilical Cord Tissue: Large Sample Size Analysis Reveals Consistency Between Donors.
- [6] Trigo CM, et al. Towards the Standardization of Mesenchymal Stem Cell Secretome-Derived Product Manufacturing for Tissue Regeneration. Int J Mol Sci. 2023.
本文旨在说明术语、制度上的定位以及品质规格的解读方法。本公司的干细胞分泌组仅作为研究用试剂（仅限研究目的使用的类别，并非药品）供应，不用于证明对任何特定疾病的疗效。