30초 요약: 이 글의 요점
- 24시간 초원심분리로도 소혈청의 RNA는 70% 안팎이 남았습니다. 실측에서 제거된 것은 총 RNA 양의 19~33%에 그칩니다.
- 남는 원인은 장비의 성능이 아니라 방법의 원리입니다. 초원심분리는 무거운 것을 가라앉혀 나누는 방법이라, 단백질과 결합해 '가라앉지 않는 형태'가 된 RNA는 걷어낼 수 없습니다.
- 이는 안전성이 아니라 측정의 문제입니다. 저자도 수용 세포에서의 기능을 보여주는 데이터는 없다고 명기하고 있으며, 논점은 분석 결과에 대한 간섭입니다.
1. 무엇을 측정했는가 — 통상보다 가혹한 조건에서의 실측
요컨대 이 연구는 '나중에 제거한다'는 절차의 실력을 통상보다 가혹한 조건에서 측정한 시험입니다. 2016년 Scientific Reports에 게재되었습니다[1]. 절차는 세 단계입니다.
- 소태아혈청(FBS)을 100,000 g · 4℃에서 초원심분리한다. 시간은 80분 · 5시간 · 24시간의 세 조건.
- 원심분리 뒤 가라앉은 쪽과 상등액 쪽으로 나눈다.
- 각각의 총 RNA 양을 측정해 얼마나 제거되었는지를 비교한다.
배양상청액(세포를 배양한 뒤 세포를 제거하고 남는 액체 전체) 분야에서는 소포를 미리 제거한 혈청(EV 고갈 FBS)을 쓰는 절차가 알려져 있습니다. 이 연구는 그 절차로 실제로 어디까지 제거되고 있는지를 직접 측정한 것입니다.
2. 결과 — 제거된 것은 19~33%, 3분의 2 이상이 남았다
24시간 초원심분리로 제거된 RNA는 전체의 19~33%였습니다. 바꿔 말하면 67~81%가 상등액 쪽, 즉 EV 고갈 FBS 쪽에 남았다는 뜻입니다. 논문 초록은 이 결과를 다음과 같이 요약하고 있습니다.
“The majority of them (>70%) are retained even after extended ultracentrifugation in the preparations of vesicle-depleted FBS”
그것들(FBS 유래 RNA)의 대부분(70% 초과)은 장시간의 초원심분리를 거친 뒤에도 여전히 EV 고갈 FBS 표품 안에 남아 있다.
Wei et al. (2016) 초록에서이 수치를 읽을 때 짚어 둘 전제가 두 가지 있습니다.
첫째, 24시간은 통상보다 가혹한 조건입니다. 논문에 따르면 많은 연구자는 70,000~110,000 g에서 2~18시간 초원심분리하여 EV 고갈 혈청을 만들며, 24시간은 이를 웃돕니다. 즉 통상적인 절차라면 남는 양은 이보다 많아진다고 읽는 것이 타당합니다.
둘째, 측정된 것은 총 RNA 양뿐입니다. 단백질·엔도톡신(세균에서 유래하는 발열성 물질)·그 밖의 혼입 성분은 측정되지 않았습니다. '불순물 전반의 70%가 남는다'는 이야기가 아니라 RNA에 한정된 수치입니다.
3. 왜 완전히 제거되지 않는가 — 가라앉지 않는 것은 가라앉힐 수 없다
결론은 단순합니다. 장비의 성능이 아니라 방법의 원리에서 오는 한계입니다. 초원심분리는 입자를 무게로 가라앉혀 나누는 방법이기 때문입니다. 막에 싸인 소포는 가라앉지만, 그렇지 않은 형태는 가라앉지 않습니다.
핵심 포인트
흙탕물을 한동안 놓아두면 모래는 바닥에 가라앉지만, 물에 녹은 소금은 아무리 기다려도 가라앉지 않습니다. 초원심분리는 이 '침전'을 강력하게 만든 조작입니다. 소포라는 '모래'는 가라앉힐 수 있어도, 단백질과 결합해 녹아 있는 RNA(소금)는 시간을 늘려도 가라앉힐 수 없습니다.
저자들도 남은 RNA의 상당 부분이 리보핵단백질 복합체(RNA가 단백질과 결합한 형태)로 존재한다고 추정하고 있습니다. 소포가 아니기 때문에, 소포를 가라앉히는 방법으로는 원리상 떨어지기 어려운 것입니다.
실측값으로는 미처리 FBS에서 5~40 ng/mL의 총 RNA가 회수되었고, EV 고갈 처리를 거친 표품에는 평균 34 ng/mL가 남아 있었습니다.
4. 남으면 무슨 일이 일어나는가 — 분석에 대한 간섭
남은 소 유래 RNA는 세포 쪽 측정 결과에 섞여 듭니다. 한마디로 '세포가 분비한 것'과 '배지에 원래 들어 있던 것'을 구별할 수 없게 된다는 뜻입니다. 논문이 제시한 것은 다음 세 가지입니다.
| 현상 | 내용 |
|---|---|
| 사람 유래로 잘못 읽힌다 | 소 유래 RNA에는 진화적으로 보존된 서열이 많아 사람 게놈에 일치해 버린다. 불일치를 전혀 허용하지 않는 조건에서도 상등액 쪽 리드의 13.2%가 사람 게놈에 정렬되었다 |
| 세포 유래로 오인한다 | 간에 특징적인 miR-122가 간이 아닌 신경교종 세포의 배양상청에서 높은 수준으로 검출되었다. 다만 사용하지 않은 신선한 배지에도 같은 정도로 들어 있어, 세포의 분비가 아니라 배지가 공급원이었다 |
| 세포 내 측정에도 섞여 든다 | 마우스에는 상동 서열이 존재하지 않는 miR-1246이 10% FBS로 배양한 마우스 세포주에서 재현성 있게 검출되었다. EV 고갈 배지로 바꾸자 신호는 유의하게 낮아졌다 |
세 가지 현상은 모두 이 '구별할 수 없게 된다'는 한 가지로 귀착됩니다. 배양상청액의 분석 데이터를 읽을 때는 그 수치가 정말 세포에서 유래한 것인지를 물어야 한다는 뜻입니다.
한편으로 이 연구가 안전성 문제를 보여준 것은 아니라는 점도 같은 무게로 짚어 둘 필요가 있습니다. 저자는 고찰에서 다음과 같이 명기하고 있습니다.
“As of today, there are no data suggesting the functional activity of this low-level bovine RNA in the recipient cells”
현시점에서 이 낮은 수준의 소 RNA가 수용 세포에서 기능적 활성을 가진다는 것을 보여주는 데이터는 없다.
Wei et al. (2016) 고찰에서논점은 안전성이 아니라 측정계에 대한 간섭입니다. 즉 무엇을 측정하고 있는지 알 수 없게 된다는 것. 이 구별을 놓치면 연구의 의미를 잘못 읽게 됩니다.
5. 어디까지 일반화할 수 있는가 — 이 연구가 보여주지 않는 것
먼저 결론을 말하면, 이 연구로 말할 수 있는 것은 '초원심분리라는 방법의 한계'까지입니다. 읽을 때의 한계를 세 가지, 분명히 적어 둡니다.
- 검증된 것은 초원심분리뿐입니다. 후속 연구에서는 막으로 걸러 나누는 한외여과를 이용한 절차 쪽이 하룻밤 초원심분리나 시판 EV 고갈 혈청보다 효율적으로 소포를 제거할 수 있었다고 보고되었습니다[2]. '어떤 방법으로도 제거할 수 없다'는 일반화는 잘못입니다
- 영향의 크기는 실험계에 따라 달라집니다. 세포가 분비하는 RNA 양에는 폭이 있어, 간섭이 두드러지는 계도 있고 거의 문제가 되지 않는 계도 있습니다
- 단일 시설·3개 로트의 결과입니다. 혈청의 브랜드, 로트, 원심분리 로터의 차이는 교란 요인으로 남습니다
두 번째 점에 대해서는 저자 자신이 다음과 같이 적고 있습니다.
“In some cases, therefore, the anticipated contribution of vdFBS-containing media would be negligible, whereas in others, it may skew the results significantly”
따라서 EV 고갈 FBS를 포함한 배지의 기여는 무시할 수 있는 경우도 있고, 결과를 크게 왜곡할 수 있는 경우도 있다.
Wei et al. (2016) 고찰에서6. 설계상의 함의 — '나중에 제거'할 것인가, '애초에 들여오지 않을' 것인가
이 연구가 보여주는 것은 '나중에 제거한다'는 발상에는 방법마다 원리적인 누락이 따른다는 점입니다. 초원심분리라면 가라앉지 않는 형태의 것이 남습니다. 방법을 바꾸면 놓치는 대상이 달라질 뿐이며, '어디까지 제거되었는가'를 계속 측정해야 하는 일은 그대로 남습니다.
다른 한쪽의 설계는 애초에 들여오지 않는 것입니다. 소혈청을 쓰지 않으면 소 유래 RNA가 섞여 드는 경로 자체가 없고, 제거율을 논의할 필요도 생기지 않습니다.
핵심 포인트
바닥에 쏟은 잉크를 완전히 닦아내기는 어렵지만, 잉크를 들여오지 않으면 닦아내는 작업 자체가 생기지 않습니다. '나중에 어디까지 제거했는가'를 계속 검증하는 설계와, '애초에 넣지 않는' 설계의 차이입니다.
일본재생의료학회의 가이던스도 동물 유래 성분을 포함하지 않는 배지를 사용해야 한다고 하며, 소태아혈청을 사용한 경우 소혈청 유래 소포가 혼입되어 예기치 않은 생물학적 활성을 나타낼 우려가 있다고 지적하고 있습니다[3].
'넣지 않는' 설계의 전체상은 '첨가하지 않는' 배지 설계에, 제법에 따른 잔류 성분의 차이는 줄기세포 배양상청액과 분비단백체의 차이에 정리해 두었습니다.
자주 묻는 질문
'70%가 남는다'는 것은 불순물 전반을 말하는 것입니까.
아니요, 총 RNA 양에 한정된 수치입니다. 이 연구에서 측정된 것은 RNA뿐이며, 단백질·엔도톡신·그 밖의 혼입 성분은 측정되지 않았습니다. 실측에서는 제거된 것이 19~33%, 남은 것이 67~81%였고, 초록이 이를 '70% 이상'이라고 표현하고 있습니다.
남은 소 유래 RNA는 몸에 해가 있습니까.
이 연구는 그것을 보여주지 않습니다. 저자는 현시점에서 이 낮은 수준의 소 RNA가 수용 세포에서 기능을 갖는다는 것을 보여주는 데이터는 없다고 명기하고 있습니다. 논점은 안전성이 아니라 측정 결과에 대한 간섭, 즉 세포가 분비한 성분과 배지에서 유래한 성분의 구별이 되지 않게 되는 것입니다.
어떤 제거 방법으로도 소 유래 RNA는 제거할 수 없습니까.
그렇게 말할 수는 없습니다. 이 연구가 검증한 것은 초원심분리뿐입니다. 후속 연구에서는 막으로 걸러 나누는 한외여과를 이용한 절차 쪽이 하룻밤 초원심분리나 시판 EV 고갈 혈청보다 효율적으로 제거할 수 있었다고 보고되었습니다. 방법에 따라 놓치는 대상이 다르다는 이해가 정확합니다.
참고문헌
- [1] Wei Z, Batagov AO, Carter DR, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Rep. 2016;6:31175. doi:10.1038/srep31175
- [2] Kornilov R, Puhka M, Mannerström B, et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1422674. doi:10.1080/20013078.2017.1422674
- [3] 일본재생의료학회(협력: 일본세포외소포학회) 「세포외소포 등의 임상 응용에 관한 가이던스(제1판)」 2024년 4월 30일
영문 인용은 참고문헌 [1]의 원문에서 발췌한 것이며, 한국어 번역은 당사가 작성한 것입니다.
본 글은 공표된 연구의 내용을 소개한 것입니다. 당사의 줄기세포 분비단백체(세포가 배양 중에 분비한 성분의 총체)는 연구용 시약으로 공급하고 있으며, 특정 질환에 대한 효과를 나타내는 것이 아닙니다. 소개한 연구는 당사 제품을 시험한 것이 아닙니다.