줄기세포 배양상청액과 분비단백체는 같은 것인가?
차이를 가르는 ‘섞지 않는’ 설계와 6가지 조건

1. 결론 — 갈림길은 ‘나중에 제거한다’인가 ‘처음부터 섞지 않는다’인가

결론부터 말씀드립니다. 배양상청액은 줄기세포를 배양한 뒤의 배양액을 ‘액째로’ 회수한 것입니다. 여기에는 세포가 분비한 성분에 더해, 배양에 사용한 배지의 성분(소혈청 등 동물유래 성분, 첨가인자)과 배양 중에 생긴 세포 파편, 암모니아가 함께 들어 있습니다.

한편 분비단백체는 이 가운데 세포가 분비한 성분만으로 구성된 것을 가리킵니다. 둘을 가르는 것은 회수 후의 정제 기술이 아닙니다. 애초에 불필요한 성분을 들이지 않는, 배지와 배양 공정의 설계입니다.

목적 성분: 사이토카인·성장인자·엑소좀 불필요 성분: 세포 파편·동물유래 혈청·첨가인자

2. 배양상청액에는 무엇이 섞여 있는가

요점은 하나입니다. 일반적인 제법에서는 세포를 키우기 위해 넣은 성분이 그대로 제품 쪽으로 넘어옵니다.

일반적인 중간엽 줄기세포(뼈나 지방 등으로 분화할 수 있는 줄기세포)의 배양에서는 세포의 증식을 돕기 위해 소태아혈청(FBS)이 들어간 배지를 사용합니다. 상청액을 회수하면 목적으로 하는 분비 성분과 함께 다음의 것들이 섞여 들어옵니다.

• 배지유래 인자: 소혈청에 들어 있는 단백질, RNA 등
• 첨가인자: 세포의 증식을 촉진하기 위해 넣은 성분
• 세포에서 유래한 불필요물: 사멸 세포, 세포 파편, 대사산물인 암모니아

이들은 제품의 목적 성분이 아닙니다. 배양 조건이나 로트에 따라 양이 변동하기 때문에 조성 편차의 원인이 되기도 합니다.

3. ‘나중에 제거한다’는 선택지와 그 한계

먼저 결론을 말씀드리면, 회수 후의 제거는 한 단계 나아간 방법이지만, 성질이 가까운 성분까지는 갈라낼 수 없다는 원리적인 한계가 있습니다.

불필요 성분을 회수한 뒤에 제거하는 방법도 있습니다. 한외여과나 크기배제 크로마토그래피(크기 차이로 성분을 걸러 나누는 방법) 등, 분자량의 차이를 이용해 분리하는 방식입니다. 아무런 처리도 하지 않은 상청액에 비하면 안전성 면에서 한 단계 나아간 방법이라고 할 수 있습니다.

다만 완전한 분리는 쉽지 않습니다. 소태아혈청에서 유래한 RNA에 대해서는, 배양세포에서 유래한 세포외 RNA의 분석에 간섭한다는 보고가 있습니다[1]. 목적 성분과 불필요 성분의 성질이 가까울수록 분리는 어려워집니다.

세포유래 인자 배지유래 인자·첨가인자

3가지 제법을 나란히 놓고 비교하면 다음 표와 같습니다.

안전성은 △ ＜ ○ ＜ ◎ 의 3단계이며, 배지유래 성분·첨가인자가 얼마나 남는지로 평가하고 있습니다.

4. 당사가 ‘분비단백체’라고 부르기 위한 6가지 조건

당사는 다음 6가지를 모두 충족하는 것만을 ‘분비단백체’라고 부르고 있습니다. 순서대로 확인해 나가는 체크리스트로도 사용하실 수 있습니다.

1. 세포 또는 조직에서 분비된 성분만으로 구성된다

   배지에서 유래한 성분이 섞인 액은 이 정의에서 벗어납니다.

2. 회수용 배지에 사이토카인(세포 사이의 정보 전달을 담당하는 단백질)이나 성장인자가 잔존하지 않는다

   회수용 배지에 성장인자(세포의 증식·복구를 촉진하는 단백질)가 들어 있으면, 제품 속의 성장인자가 ‘세포가 분비한 것’인지 ‘원래 배지에 들어 있던 것’인지 구별할 수 없습니다. 성분표의 수치가 무엇을 의미하는지가 모호해집니다.

3. 단백질, 펩타이드, 핵산, 엑소좀(세포가 방출하는 미세한 막 주머니) 등의 막소포를 포함한다

   세포가 분비한 성분의 총체여야 한다는 요건입니다.

4. 암모니아, 중금속 등의 유해물질, 사멸 세포 등의 불순물을 포함하지 않는다

   배양 중에 생기는 대사산물이나 세포에서 유래한 불필요물을 제품에 들이지 않는다는 뜻입니다.

5. 소혈청을 사용하지 않는다

   소혈청을 사용하는 한, 제거 처리를 아무리 거듭해도 유래 성분의 잔존을 완전히 부정할 수는 없습니다. 사용하지 않는다는 선택이 설명 가능성을 가장 단순하게 만듭니다.

6. 성분에 대한 근거가 있다(단백질 정량, 주요 사이토카인 측정, 엑소좀 분석 등)

   정의를 내세우는 데 그치지 않고, 측정 데이터로 보여줄 수 있어야 한다는 것입니다.

실무에서 특히 크게 작용하는 것이 조건 2와 조건 5입니다. 둘 다 성분표의 수치를 ‘어디에서 왔는가’라는 유래에서부터 설명할 수 있는지와 직결됩니다.

이 6가지 항목을 공급처에 대한 질문 목록으로 재구성한 내용을 배양상청액·분비단백체 선택 방법에 정리해 두었습니다. 비교 검토 시 활용해 주십시오.

5. 도입하는 쪽에서는 무엇이 달라지는가

제법의 차이는 일상적인 운용에서 ‘편차가 적다’와 ‘설명하기 쉽다’라는 형태로 나타납니다. 구체적으로는 다음 3가지입니다.

조성의 편차가 줄어든다

배지에서 유래한 성분이 들어가지 않는 만큼, 로트 간에 변동하는 요소가 줄어듭니다. 당사는 전 로트에서 사이토카인 양과 엑소좀 내 miRNA 양을 측정하고 그 결과를 공개하고 있습니다.

성분의 유래를 설명할 수 있다

‘이 성분은 어디에서 왔는가’라는 물음에 제법에서부터 답할 수 있습니다. 취급 기록이나 설명이 요구되는 자리에서 유래를 거슬러 확인할 수 있다는 것의 가치는 작지 않습니다.

동물유래 성분에 관한 설명이 단순해진다

소혈청을 사용하지 않기 때문에, 동물유래 성분에 관한 우려에 대해 제거율이 아니라 ‘사용하지 않는다’고 답할 수 있습니다.

자주 묻는 질문

분비단백체는 배양상청액의 일종입니까?

넓은 의미에서는 둘 다 세포를 배양한 액에서 얻어지는 것입니다. 다만 당사는 본문의 6가지 조건을 모두 충족하는 것만을 분비단백체라고 부릅니다. 시장에는 같은 용어를 더 넓게 사용하는 예도 있으므로, 구매 시에는 정의와 성분 데이터의 유무를 확인해 주십시오.

엑소좀만 분리한 제품과는 무엇이 다릅니까?

분비단백체에는 엑소좀에 더해 사이토카인이나 성장인자 등의 가용성 인자(액에 녹은 상태로 작용하는 성분)가 포함됩니다. 엑소좀만을 분리한 제품에는 가용성 인자가 포함되지 않습니다.

성분 데이터는 공개됩니까?

제조 로트마다 사이토카인 양과 엑소좀 내 miRNA 양을 측정하고 있으며, 요청에 따라 시험성적서와 성분 데이터를 제공하고 있습니다. 자세한 내용은 안전 · 품질 체계를 참조해 주십시오.

참고문헌

• [1] Wei Z, Batagov AO, Carter DR, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Rep. 2016;6:31175. doi:10.1038/srep31175

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