Суть статьи за 30 секунд
- «Число» меняется в миллион раз в зависимости от метода. Сравнивать числа у продуктов, измеренных на разных приборах, бессмысленно.
- Вместе с везикулами считаются примеси. Даже если написано «столько-то экзосом», на деле могут подсчитываться и комки белка.
- Больше — не значит сильнее. На нынешнем уровне науки нет оснований читать большее число как более выраженное действие.
Дальше разбираем эти три пункта по очереди — как три ловушки. Каждую из них можно проверить по оригинальному тексту международного руководства.
Прибора, который точно посчитал бы именно экзосомы, пока не существует
Почему «столько-то триллионов частиц» — ненадёжная цифра
Исследования внеклеточных везикул (мельчайших пузырьков в мембранной оболочке, которые выделяет клетка; экзосомы — один из их видов) опираются на руководство по отчётности, которое выпускает Международное общество по внеклеточным везикулам (ISEV). Актуальная редакция — MISEV2023[1].
Это руководство прямо указывает, что у измерения числа частиц есть предел. Причина проста: ни один доступный сегодня прибор не умеет отобрать одни лишь экзосомы и пересчитать их полностью.
“…the number concentration (in particles/mL), a metric that is widely reported and used for … in vivo dosing. However, it is often unreliable, since many techniques lack specificity for EVs and sensitivity for all EVs.”
Число везикул вместе с измерением объёма даёт числовую концентрацию (частиц/мл) — показатель, который широко публикуют и используют для стандартизации количества материала в анализах, для представления результатов и для расчёта дозы in vivo. Однако он часто ненадёжен, поскольку многим методам не хватает специфичности к внеклеточным везикулам и чувствительности, позволяющей уловить все везикулы.
MISEV2023, раздел 5.1 «Количественная оценка числовой концентрации частиц»Поэтому руководство и не рекомендует писать «концентрация экзосом»
MISEV2023 идёт дальше и прямо формулирует рекомендацию.
“Unless methods are highly specific for EVs, the output of these measures should be described as pertaining to ‘particles’ or ‘EPs’.”
Если метод не обладает высокой специфичностью к внеклеточным везикулам, результат такого измерения следует описывать как относящийся к «частицам» или «внеклеточным частицам».
MISEV2023, раздел 5.1, рекомендацииИначе говоря, правильное название для этой цифры — «концентрация частиц», и в неё входят примеси неустановленной природы. С размером то же самое: руководство просит писать «размер частиц», а не «диаметр везикул».
Обратная сторона этого такова: если в материале утверждается «столько-то экзосом», уже одно это требует выяснить, что именно и каким образом было подсчитано.
Смените метод — и для одного и того же образца число разойдётся до миллиона раз
«У компании A — 10 миллиардов, у компании B — 10 триллионов, значит B лучше» — так не работает
Это распространённое заблуждение. Описано, что для одного и того же образца достаточно сменить прибор (метод) — и результат меняется на шесть порядков, то есть примерно в миллион раз.
“Note that reported EV concentration in blood plasma spans six orders of magnitude depending on the measurement method.”
Публикуемые значения концентрации внеклеточных везикул в плазме крови различаются на шесть порядков — примерно в миллион раз — в зависимости от применённого метода измерения.
MISEV2023, раздел 5.1 (первоисточник: Johnsen et al., 2019)Это не погрешность. Разрыв возникает потому, что каждый метод «видит» своё. Поэтому ставить рядом цифры, полученные разными методами, и сравнивать их — лишено смысла.
Что каждый метод упускает и что считает лишним
NTA (анализ траекторий наночастиц)
Самый распространённый метод. Частицы подсвечивают и отслеживают их движение, но при такой схеме экзосомы невозможно отличить от обычных комков белка (агрегатов). То же касается липопротеиновых частиц сывороточного происхождения. Всё, что примешано, добавляется к числу (пересчёт). В обратную сторону: фактический предел обнаружения составляет, по имеющимся сообщениям, примерно 50–70 нм, а для везикул — 70–90 нм, и всё, что мельче, в образце есть, но в счёт не попадает (недосчёт).
TRPS (метод резистивного импульса)
Измеряет изменение электрического сопротивления при прохождении частицы через тонкую пору. Нижняя граница задана чувствительностью прибора, верхняя — диаметром поры. Сильной стороной считают разрешение на образцах с широким разбросом размеров, хотя есть сообщения, что ниже 150 нм NTA выявлял больше частиц.
ELISA (CD9, CD63, CD81)
Измеряет количество белков-маркеров на поверхности везикул. Однако не каждая везикула несёт эти маркеры. MISEV2023 прямо указывает, что методы, основанные на этих трёх маркерах, не специфичны к подтипу «экзосомы».
Общее содержание белка
Суммарное количество белка в образце. Поскольку сюда входят и компоненты питательной среды, это не мера количества самих везикул.
Всё это на одном рисунке выглядит так.
О модальном размере, который NTA даёт для частиц с низким показателем преломления, MISEV2023 предупреждает: он «возможно, отражает предел обнаружения прибора», а не истинное значение для популяции везикул, — и требует приводить само распределение по размерам, а не только среднее. Материал, в котором стоит одно лишь «в среднем столько-то нм», в этом отношении неполон.
Не считает руководство достаточным и какой-либо один метод.
“As a result, no single measurement or method is able to satisfy all EV characterization requirements, and use of orthogonal methods (those that do not have the same measurement limitations) is recommended.”
Как следствие, ни одно отдельное измерение и ни один отдельный метод не способны удовлетворить всем требованиям к характеристике внеклеточных везикул, поэтому рекомендуется сочетать ортогональные методы — те, которые не имеют одних и тех же ограничений измерения.
MISEV2023, начало раздела 5 «Характеристика внеклеточных везикул»У утверждения «больше частиц — сильнее действие» научных оснований пока нет
Это самый важный пункт
На сегодняшний день данных о том, что большее число частиц даёт более выраженное биологическое действие, нет.
Напротив, описаны препараты, у которых число частиц, размер частиц и количество типичных маркеров были сопоставимы, а реальная биологическая активность различалась полностью. Стандартизованное испытание активности (проверка силы действия) не установлено, поэтому нет и критерия вида «столько-то частиц — и работает»: самой величины «оптимальное число частиц» попросту не существует.
Дозы, применявшиеся в клинических исследованиях, тоже различаются от одного способа получения к другому и не приведены к виду, допускающему сквозное сравнение.
Чтение, при котором продукты сравнивают по величине «числа» из брошюры, на сегодня не имеет под собой оснований.
Чтобы не возникло недопонимания: само по себе измерение числа частиц не бессмысленно. Если измерять одним и тем же методом на постоянной основе, число хорошо работает как показатель разброса между партиями. Проблем ровно две: расставлять продукты по местам, сравнивая цифры, полученные разными методами, и читать большее число как более сильное действие.
Четыре пункта для проверки, когда вы читаете материалы о продукте
Итак, если перед вами материалы нескольких производителей, куда смотреть, чтобы подойти ближе к действительному качеству? Вот эти четыре пункта.
-
Указано ли, каким прибором (методом) проводили измерение
Цифру без указания метода бессмысленно сравнивать с цифрами других компаний. Как сказано выше, одна лишь разница в приборе даёт расхождение до миллиона раз.
-
Приведено ли рядом с числом частиц и содержание белка
Руководство Японского общества регенеративной медицины[2] считает желательным наличие корреляции между числом частиц и содержанием белка. По одной цифре не понять, насыщено содержимое этих частиц или разбавлено.
-
Сколько поверхностных маркеров исследовали и каким образом
Международный позиционный документ требует полуколичественного анализа не менее чем по трём маркерам. Один-единственный маркер — слабое обоснование.
-
Как оценивают и удаляют примеси, не являющиеся везикулами
Большое число мало чего стоит, если это в основном ненужные белковые агрегаты. MISEV2023 включает проверку того, сколько в препарате невезикулярного материала, в перечень позиций для отчёта.
Материал, где раскрыты все четыре пункта, можно по меньшей мере читать как цифры, приведённые с пониманием пределов измерения. Материал, где крупно набрано только «столько-то триллионов частиц», больше этого ничего не сообщает.
О терминах — «экзосома» и «внеклеточная везикула (EV)»
MISEV требует использовать в качестве общего термина внеклеточные везикулы (EV), пока путь их образования не доказан строго: слово «экзосома» подразумевает происхождение из мультивезикулярного тельца — внутриклеточной структуры.
Большинство коммерческих продуктов маркируют как «экзосомы», но на деле это чаще всего смесь везикул с неустановленным происхождением.
Материал, в котором намеренно разграничены точные термины — «внеклеточные везикулы (EV)», «секретом», — один из признаков производителя, который опирается на научный контекст.
Определение самих экзосом, путь их образования и строение изложены в материале «Что такое экзосома»; о том, что теряется при выделении одних лишь мембранных пузырьков, — в материале «Что теряется, если выделить только экзосомы»; а показатели, которых требует национальное руководство, — в материале «Что такое кондиционированная среда стволовых клеток».
Часто задаваемые вопросы
Лучше ли тот продукт, в котором больше частиц?
Оснований для такого вывода на сегодня нет. Описаны случаи, когда при сопоставимых числе частиц, размере частиц и количестве типичных маркеров биологическая активность различалась значительно. Кроме того, стандартизованное испытание активности не установлено, поэтому самой величины «оптимальное число частиц» не существует. Обращайте внимание не на величину числа, а на то, каким методом проводили измерение и как оценивали посторонние примеси помимо частиц.
Можно ли сравнивать число частиц у других компаний с нашими цифрами?
Сравнение возможно только при одинаковом методе измерения. MISEV2023 отмечает, что публикуемые значения концентрации внеклеточных везикул в плазме крови различаются в зависимости от метода на шесть порядков (примерно в миллион раз). Это не погрешность, а разница, возникающая из-за того, что каждый метод видит своё.
Служит ли обнаружение маркеров, например CD9, доказательством качества?
Маркеры подтверждают, что везикулы присутствуют, но показателем качества не являются. Не все везикулы несут одни и те же маркеры, и MISEV2023 прямо указывает, что методы, основанные на CD9, CD63 и CD81, не специфичны к подтипу «экзосомы». Там же сказано, что универсального маркера, позволяющего выявить все внеклеточные везикулы независимо от их происхождения, на сегодня не известно.
Источники
- [1] Welsh JA, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2):e12404. (Международное общество по внеклеточным везикулам, ISEV)
- [2] Японское общество регенеративной медицины (при участии Японского общества по внеклеточным везикулам). «Руководство по клиническому применению внеклеточных везикул и родственных продуктов» (1-я редакция), 30 апреля 2024 г.
Цитаты на английском — выдержки из оригинального текста MISEV2023; перевод на русский выполнен нашей компанией.
Настоящая статья описывает методы измерения и их пределы. Секретом стволовых клеток нашей компании (совокупность компонентов, выделенных клетками в ходе культивирования) поставляется как реагент для научных исследований и не предназначен для демонстрации эффективности при каких-либо заболеваниях.
Спецификация секретома стволовых клеток Запросить аналитические данные